서 론

개구리류의 정소주기는 정소의 크기와 구조 및 세정관 내에 존재하는 생식세포들의 변화를 관찰하여 파악한다 (Iwasawa and Asai, 1959 ; Rastogi, 1976; Polzonetti – Magni et al., 1990). 연중 정자형성과정이 진행되는 연속형 (continuous type)과 정자형성과정이 계속해서 진행되어지 다가 일정시기에만 생식세포들의 감수분열이 억제되는 잠 재적 연속형(potentially continuous type), 번식기 이후 일 정기간 동안 생식세포의 형성 및 발달이 정지된 정지기 (quiescent period)를 갖는 불연속형(discontinuous type) 등 세 가지 유형으로 분류한다(Lofts, 1974). 연속형의 정자형성주 기를 갖는 양서류는 열대 및 아열대 지역에 서식하는 종에서 나타나며, 남부유럽에 서식하는 edible frog(Rana esculenta) 와 인도에 서식하는 Javanese toad(Bufo melanostictus)가 연 속형 주기를 갖는 것으로 알려져 있다(Kanamadi and Saidapur, 1982; van Tienhoven, 1983). 잠재적연속형의 정 자형성주기를 갖는 양서류는 북부유럽에 서식하는 edible frog(R. esculenta)와 natterjack toad(B. calamita)가 대표적 인 종으로 알려져 있으며(Champy, 1913; van Tienhoven, 1983) 불연속형의 정자형성주기를 갖는 종으로는 common frog (R. temporaria)가 알려져 있다(van Tienhoven, 1983). 이와 같이, 개구리류의 정소주기는 환경적 요인과 서식지 기후조건 및 종(species)에 따라 차이가 크게 나타나는 것으 로 알려져 있다(Kera and Iwasawa, 1981 ; Bentley, 1982 ; Yoneyama and Iwasawa, 1985). 국내에 서식중인 양서류 중 북방산개구리(R. dybowskii) (Ko et al., 1993; Ko et al., 1997; Ko et al., 1998)와 한국산개구리 (R. coreana) (Shin and Ko, 2014)는 불연속형의 정자형성주기를 갖는 것으로 알려져 있으며, 옴개구리(R. rugosa)(Ko et al., 1997; Ko et al., 1998)와 참개구리(R. nigromaculata) (Ko et al., 1997; Ko et al., 1998), 황소개구리(R. catesbeiana) (Kim and Ko, 1998; Ko, 2000)는 잠재적연속형의 정자형성주기 를 갖는 정소주기를 나타내는 것으로 보고되었다.

이와 같이 정소주기에 관한 연구는 국내외에 서식하는 종들을 대상으로 활발하게 연구가 진행되었으나 국내에 서 식하고 있는 두꺼비(B. gargarizans)의 정소주기에 대한 연구는 이루어진 바 없다. 따라서 본 연구에서는 국내 서식 중인 두꺼비의 수컷을 대상으로 세정관의 생식세포 수 및 생식세포 낭 수의 변화를 연중 조사하고 세정관을 단위로 분열중인 생식세포와 정자의 분포양상의 변화를 조사하여 두꺼비 정소주기를 파악하고자 연구를 실시하였다.

재료 및 방법

1실험동물 및 서식지 기후조건

두꺼비(B. gargarizans)는 정읍시에서 포획허가를 받아 2012년 3월부터 2013년 2월까지 전라북도 정읍시 일대의 평 야지대에서 매월 하순에 매월 3마리 이상의 성체를 채집하여 3일 이내에 실험을 실시하였다. 이들의 서식지 기후조건을 조 사하기 위해 기상연보(Korea Meteorological Administration, 2012; 2013)를 활용하여 채집지역의 강수량과 기온, 낮의 길이 등을 조사하였다.

2체중, 정소무게, GSI 조사

체중은 동물 저울(triple beam balance,OHAUS: GT480)을 이용하여 측정하였으며, 채취한 정소는 화학천칭(Denver instrument CO.,AA-250: GT4800)을 사용하여 무게를 측정하 였다. 정소는 3% neutral formalin에 고정하였다. Gonado Somatic Index(GSI)는 체중/정소무게×100으로 계산하였다.

3정소 내 구조변화 조사

고정시킨 정소의 조직학적 특징을 파악하기 위해 paraplast 에 포매하여 5∼6㎛로 절편하였다. 이 절편들을 hematoxylin 과 eosin으로 대비 염색하고 정소의 세정관에 존재하는 생 식세포와 정자의 존재양상을 중심으로 세정관 내 단면적 구조변화를 연중 조사하였다. 검경은 정소의 중앙에 위치하 는 세정관을 포함하여 인접해 있는 5개의 세정관을 무작위 로 선택하여 실시하였다. 정소 내 세정관 단면적의 크기는 Yoneyama(1985)의 방법에 따라 세정관의 장축과 단축 계 측 시 AM-423x Dino-Eye 와 Dinocapture 2.0 program (ANMO)을 이용, 세정관의 넓이 변화를 조사한 후 세정관 에 존재하는 생식세포의 분포양상을 중심으로 세정관 내의 단면적 구조변화를 연중 조사하였다. 세정관내에 존재하는 생식세포의 발생단계를 분류하기 위해 생식세포의 cyst 형 성 유무와 cyst 내의 생식세포 수(van tienhoven, 1983) 및 생식세포 핵의 크기(Rastogi et al., 1983)에 따라 세정관내 에 cyst를 형성하여 존재하는 생식세포군을 제1정원세포 (primary spermatogonia: PSG), 제2정원세포(secondery spermatogonia: SSG), 제1정모세포(primary spermatocyte: psc), 제2정모세포(secondary spermatocyte: ssc), 정세포 (spermatid: st) 등 5단계로 분류하였다(Rastogi, 1976; Mathews, 1986)(Table 2).

이와 함께 정자의 분포양상을 중심으로 세정관을 단위로 하여 생식세포 변화 단계를 Nagahama(1986)와 Matsuyama et al. (1991)의 분류방법에 따라 다음과 같이 분류하였다. 세정관내에 모든 발달단계의 생식세포들이 존재하며 세정 관의 강소(lumen)는 형성되지 않았으며 소수의 정자들만이 존재하는 전기 정자형성단계(Early spermatogenesis)와 세 정관의 강소가 형성되고 다수의 정자들이 형성되어 있으며 정자들이 세정관의 강소내로 이동되지 않고 있는 후기 정자형 성단계(Late spermatogenesis), 완성된 정자들이 세정관의 강 소로 이동되어 지고 있는 상태를 정자이동단계(Spermiation), 배출 후 세정관의 잔류 정자들과 제 1정원세포들이 같이 나타 나는 정자배출 후 단계(Post-spawning)로 정하였다(Table 1).

3통계처리

정소 무게 와 GSI, 세정관 단면적, 생식세포들의 연중변 화 검정은 One-way analysis of variance (ANOVA)에 이은 Duncan's multiple range test를 통해 유의성 검정을 실시하 였으며 p<0.05를 유의한 것으로 판단하였다.

결 과

1서식지 연중 기후 변화

두꺼비 서식지의 계절 변화에 따른 환경 요인을 조사하기 위하여 기온과 낮의 길이 및 강수량의 연중 변화를 기상청 의 2012, 2013년 월별 평균자료를 참고한 결과 정읍시의 겨울철(12~2월) 평균온도는 –1.1~1.1℃ 사이를 나타냈으며 여름철(6~8월)의 평균온도는 23.5~27.6℃를 나타냈으며 강수량은 7~9월에 240㎜ 이상을 기록했으나 이 시기 이외 에는 80㎜ 이하를 나타냈다. 낮의 길이는 1월에는 약 10시 간을 나타냈으며 이후 점차 낮의 길이가 길어져 여름철인 6월에는 14.3시간으로 가장 길었고 겨울철인 12월에는 9.5 시간으로 가장 짧았다(Figure 1).

2GSI, 정소 무게, 세정관 단면적의 변화

두꺼비의 정소주기를 조사하기 위해 매월 3∼5마리 수컷 두꺼비를 취하여 체중 및 정소무게, GSI, 세정관단면적의 연중 변화를 조사하였다. 정소주기에 따른 체중, 정소 무게, GSI, 세정관 단면적의 연중 변화를 조사한 결과 정소의 무게 는 3월에 약 0.11g으로 가장 낮게 나타났다. 이후 4월부터 점차 증가하기 시작하여 7월에 약 0.28g으로 가장 높게 나타 났다. 8월에는 약 0.25g 정도로 감소하기 시작하여 이듬해 2월까지 평균 약 0.24g을 유지하였다(Figure 2A, p<0.05).

GSI도 3월에 약 0.21로 가장 낮은 수치를 나타냈으며 4월 0.23, 5월 0.26으로 점차 증가하여 7월에 평균 0.57로 최대를 나타냈다. 이후 9월까지 0.53 정도를 유지하다가 10 월에 약 0.40로 감소하여 2월까지 0.35~0.40이내의 값을 유지하였다(Figure 2B, p<0.05).

세정관 단면적의 연중변화 역시 3월에 가장 좁은 면적을 나타냈으며(약 0.033㎟) 5월까지 서서히 증가하다가 6월에 평균 0.074㎟로 급격하게 증가하였다. 7월에는 평균 0.098 ㎟로 연중 가장 넓은 단면적을 유지하다가 8월부터 점차 줄어들기 시작하여 12월에는 약 0.041㎟까지 감소하여 이 듬해 2월까지 비슷한 넓이를 유지하여(Figure 2C, p<0.05) 정소무게, GSI, 세정관 단면적이 연중 유사한 변화양상을 나타내었다(Figure 2A, B, C).

3생식세포 분류

세정관 내에 발달중인 생식세포들을 분류하기 위해 Rastogi(1983)의 방법에 따라 세정관 안쪽의 기저막(basal membrane) 에 1개의 sertoli cell과 낭을 형성하지 않은 하 나(1 cell/cyst)의 세포로 존재하고 핵의 직경은 8∼12㎛를 나타내는 제1 정원세포(primary spermatogonia), 2∼8 (cell/cyst) 정도의 세포를 포함하여 낭을 형성하였으며 세포 핵의 직경은 5∼8㎛를 나타내는 제2 정원세포(secondary spermatogonia), 9∼18 (cell/cyst) 정도의 세포를 포함하여 하나의 낭을 이루고 생식세포들의 핵의 직경은 3∼5㎛를 나타내는 제1 정모세포(primary spermatocytes), 19∼32 (cell/cyst) 정도의 세포들이 하나의 낭을 형성하였으며 이들 핵의 직경이 1∼2㎛를 나타내는 제2 정모세포(secondary spermatocytes), 33∼64 (cell/cyst) 내외의 세포를 포함한 낭으로 존재하고 핵의 직경은 0.5∼1㎛를 나타내는 정세포 (spermatids)로 각각 분류하였다(Table 2).

4생식세포 변화 및 세정관 내의 구조 변화

제 1 정원세포(primary spermatogonia: PSG)는 3월에 각 세정관 당 약 2개로 출현하기 시작하여 연중 최대값을 나타 내다가 4월부터 평균 0.5개로 감소하기 시작하여 5월까지 존재하였다(P<0.05)(Figure 3, Figure 4D) 제 2 정원세포 (secondary spermatogonia: SSG)를 갖는 cyst(낭)들은 4월 에 평균 1개가 출현하였으며 5월에 약 2개로 최대치를 나타 낸 후 점차 감소하기 시작하여 8월 이후에는 세정관 내에 존재하지 않았다(P<0.05)(Figure 3, Figure 4A). 제 1 정모 세포(primary spermatocyte: psc)를 가진 cyst (낭)들은 4월 부터 일부의 세정관에서 출현하였으며 6월에 급격히 증가 하기 시작하여 7월에 약 3개가 나타나 최대치를 나타내었으 나 이후 서서히 감소하여 11월부터 관찰되지 않았다 (P<0.05)(Figure 3 Figure 4B). 제 2 정모세포(secondary spermatocyte: ssc)의 낭들은 6월에 일부의 세정관에서 관 찰되기 시작하여 점차 증가하기 시작하여 8월에 평균 2개로 최대치를 나타내다가 2월까지 서서히 감소하였다(P<0.05) (Figure 3, Figure 4C). 정세포(spermatid: st)는 6월에 일부 나타나기 시작하여 점차 증가하다가 11월에 2개 정도로 최 대치를 나타냈으며 12월부터 이듬해 2월까지 감소하였다 (P<0.05)(Figure 3, Figure 4B).

또한, 정자형성 및 이동, 배출의 진행시기를 조사하기 위 해 각 세정관을 단위로 세정관 내에 존재하는 분열중인 생 식세포와 정자의 분포양상을 조사하여 정소주기를 파악하 였다. 즉, 전기 정자형성단계(Early spermatgenesis)는 4월 에 88%의 비율로 관찰되기 시작하여 5월에는 100%로 모 든 세정관에서 전기 정자형성단계가 확인되었다. 이후 점차 비율이 줄어들어 8월에는 6%를 나타냈으며 9월부터 3월까지 관찰되지 않았다. 후기 정자형성단계(Late spermatogenesis) 는 5월부터 관찰되기 시작하여 8월에 71%의 비율로 최대를 나타냈으며 점차 감소하여 12월에는 6%의 비율로 존재하 였다. 정자이동단계(Spermiation)는 8월에 24%의 비율을 나타냈으며 9월부터 점차 증가하여 1월에는 100%의 비율 로 존재하였다. 이후 2월에는 41%의 비율로 감소를 나타내 었다. 정자배출 후 단계(Post-spawning)는 2월에 59%의 비 율로 확인되기 시작하여 3월에 100%의 비율로 존재하다가 4월에 12%로 감소하였으며 5월부터 1월까지는 세정관 내 에서 관찰되지 않았다(Figure 4).

고 찰

개구리류의 정자형성은 감수분열이 진행되는 제1 정모세 포의 분열로부터 시작된다. 이러한 정자형성은 양서류의 경 우 세정관내의 제1 정원세포로부터 분열되는 생식세포들이 제2 정원세포에 이르면 하나의 낭(cyst)을 형성하여 생식세 포들은 낭 내에서 동시적으로 분열되며 이들 웅성생식세포 의 분열 양상은 종(species)과 이들의 서식지 환경조건에 따라 다른 것으로 알려져 있다(van Tienhoven, 1983). 본 연구에서 두꺼비도 다른 개구리류와 유사하게 제2 정원세 포부터 낭이 형성됨을 확인하였다.Fig 5

본 연구에서 3월에 채집했던 두꺼비 정소의 세정관에서 는 배출 후 세정관의 잔류 정자들과 제 1정원세포들이 같이 나타나는 정자배출 후 단계(post-spawning)를 나타내었으 며 정자형성과정은 진행되지 않았다. 이와 같이 정자형성주 기 중 제1 정모세포의 증식이 일시적으로 억제되는 시기가 존재하는 정자형성주기의 유형은 온대지방에 서식하는 일 부의 양서류에서 발견되어 이를 잠재적 연속형(potentially continuous type)으로 부른다(van Tienhoven, 1983). 이러 한 정소주기를 갖는 양서류 중 생식세포 및 생식세포 낭의 증가와 정자형성의 활성화, GSI 증가현상이 잘 일치하는 종으로는 R. esculenta(Rastogi et al., 1976)와 B. japonicus (Moriguchi and Iwasawa, 1987) 등이 잘 알려져 있다. 본 실험에 사용했던 두꺼비도 정소의 무게와 GSI 및 세정관 단면적이 번식기(3월)에 모두 낮게 나타났으나 전기 정자형 성단계(Early spermatogenesis)와 후기 정자형성단계(Late spermatogenesis)의 비율이 높게 나타난 활동기인 7월과 8 월에는 GSI가 크게 증가하고 세정관 단면적도 가장 넓고 정소의 무게도 연중 최고치를 나타내어 두꺼비의 정소주기 는 정자형성 활성과 GSI 및 세정관단면적 변화가 일치된 잠재적 연속형으로 분류할 수 있었다.

또한, 정소의 세정관 내 발달중인 생식세포 낭의 분포 및 정자들의 존재 양상 등을 조사한 결과 감수분열이 시작 되는 제1 정모세포는 4월부터 극히 일부의 세정관에서 관찰 되기 시작하여 7월에 가장 활발하였으며 완성된 정자들이 세정관의 강소로 이동되어지는 정자이동과정(spermiation) 은 8월부터 시작되어 1월에 가장 활발하였고, 2월의 정소에 서부터 정자배출 후 단계가 관찰되어졌으며 3월에는 세정 관내에 다수의 제1 정원세포들과 함께 일부의 잔류 정자들 만이 남아있는 현상이 대부분의 세정관에서 관찰되어져 이 는 2월부터 3월 사이에 번식이 이루어짐을 의미하며 이러한 사실은 야외관찰에서 두꺼비 암컷이 2~3월에 산란한다는 사실과 일치하여 두꺼비의 번식기가 2~3월임을 확인할 수 있었다.

한편, 대부분의 척추동물에서 정소주기를 조절하는 요인 에는 매년 일정한 주기를 나타내는 낮의 길이와 온도가 번 식기 등을 조절하는 가장 중요한 환경요인으로 알려져 있 다. 즉 낮의 길이가 짧고 기온이 낮은 시기인 겨울에는 정자 형성은 억제되며, 낮의 길이와 기온이 증가하기 시작한 봄 에는 개체들의 번식이 시작되었고 낮의 길이가 길고 기온이 높은 여름에는 정소내에서 활발한 정자형성이 진행되어 많 은 수의 제1 정모세포가 존재하는 것으로 알려져 있으며 (Norris and Jones, 1987) R. esculenta(Rastogi et al., 1976), R. peregi(Delgado et al., 1989), Pachymedusa dacnicolor (Bagnara, 1990) 등의 개구리에서도 온도가 높은 시기에 정자형성이 활발하였으나 온도가 낮고, 낮의 길이가 짧은 시기에는 정자형성은 억제되고 특히, R. esculenta의 경우 정원세포들의 증식은 온도의 영향으로 진행됨이 알려져 있 다(Minucci et al., 1986).

본 연구에서도 낮의 길이도 길고 기온이 연중 가장 높게 나타난 7~8월에 두꺼비 세정관내의 제1 정모세포들이 급격 히 증가하여 정자형성이 활발히 진행되었으나 기온이 낮아 지고 낮의 길이가 짧아지는 동면기(11월)에는 제1 정모세포 의 수가 점차 감소하여 나타나 국내 서식 중인 두꺼비도 온대지방의 다른 개구리류와 유사한 경향을 나타내어 환경 적인 요인(주로 온도와 낮의 길이)과 정소주기의 비교적 일 정한 관계는 확인할 수 있었으나 두꺼비 정소의 세정관내 생식세포를 포함한 낭들의 생식세포 분열이 암컷 개구리의 여포내 난자들처럼 동시적으로 성숙하는 것이 아니라 각각 의 낭들이 각기 다른 단계의 성숙분열과정을 함께 나타내어 세정관내 생식세포들의 분열과정에 대한 환경적 요인과의 관계를 명확히 규명하기에는 난점이 있다. 따라서 생식세포 들의 분열 및 변화과정과 환경적 요인 및 호르몬과의 관계 를 규명하기 위해서는 동일한 발생단계의 세포 및 낭들을 분리하여 환경적 요인 조절과 호르몬 처리에 의한 발생단계 를 파악하는 구체적인 연구가 더 필요한 것으로 생각된다.