서 론
해양 착생생물이란 연안환경에서 미생물이나 해조류, 저 서생물 등이 동물이나 식물 또는 바위, 암석 및 인공체 표면 에 착생하여 성장하는 생물을 의미한다(Evan, 1981). 착생 생물의 기작은 목적체가 해수와 접촉하면서 유기표피 (organic surface)를 형성하고 초기착생생물들이 유기표피 의 기질적 특성에 따라 착생하여 생체막(biofilm)형성하면 서 착생천이에 따라 후기착생을 형성한다(Shin, 1995). 착 생과정은 수 분 안에 유기물들이 표면에 유기막을 형성하 고, 조건이 갖춰지면 약 1~7일 내로 초기 착생 생물인 박테 리아, 규조류, 거대 해조류 포자, 원생동물 등이 착생하게 되며, 그 후로 동물성 거대 착생 종인 홍합의 유생, 따개비 등이 착생하게 된다(Yebra et al., 2004). 그러나 반드시 순 차적으로 발생하는 것이 아니며 다양한 해역에서 환경의 영향에 의해 다르게 발생할 수 있다(Kim et al.,2010). 저서 성 생물의 경우 착생에 영향을 미치는 환경요인으로 물리적 인 환경조건에 반응하여 착생하거나, 두 번째는 착생표피의 화학물질구성에 의해 착생되어지며 경우에 따라서 해수의 유동적인 움직임으로 인해 수동적으로 착생 된다고 보고 된 바 있다(Crisp and Meadows, 1962; Thorson, 1966). 그 러나 해양생물의 착생은 인공구조물, 선박 등에 마찰저항이 늘어나고 선박의 선속 저하 및 무게증가로 인하여 연료 소 비 증가와 표면의 부식상승효과가 일어나는 문제를 일으킨 다(Townsin, 2003). Champ(2000)의 연구에 따르면 해양생 물의 착생에 의한 연료소모는 최대 40%까지 증가하는 것으 로 나타났고, 선체에 약 1mm 두께의 착생이 형성되면 연료 효율이 약 10% 감소되며, 컨테이너선과 유조선의 연료소모 량을 근거로 금액으로 환산하게 되면 전 세계적으로 연간 20억 달러의 연료비 손실에 해당하는 것으로 보고되었다 (Wang et al., 1999). 또한 양식장 그물의 해양생물 착생은 부영양화를 초래하기도 하는데 각종 질병과 용존산소량의 감소를 나타낸다(Cronin et al., 1999).
착생 생물을 저해하기 위해 독성물질인 방오제와 수지를 혼합하여 방오도료를 도장하여 사용하고 있으며, 초기에는 독성물질로서 유기비소, 수은화합물, 유기주석 등이 사용되 었으나, 유기 주석(TBT)의 경우에는 방오능이 우수하나 해 양생태계에 축적되고 생물체 내부의 호르몬 균형을 깨뜨려 연체동물인 경우에는 암컷의 수컷화(imposex)현상을 유발 하는 것으로 알려져 UN 산하조직인 International Marintime Organization(국제해사기구)에 의하여 Antifouling System 협약을 선포함으로 전 세계적으로 2003년 1월 1일 이후 사 용금지 되었다(Evans et al., 2000; IMO, 2001; Strand and Asmund, 2003).
TBT 사용 금지 후 대체 물질로 아산화동을 사용하고 있 으나 아산화동의 방오능이 TBT에 비해 저조하여 아산화동 에 신방오제를 첨가하여 사용하고 있는 실정이다(Stupak et al., 2003). 현재 사용되는 신방오제는 4,5-dichloro-2-n-octyl- 4-isothiazolin-3-one(Sea-nine 211), 3-(3,4-dichlorophenly)- 1,1-dimethylurea(Diuron), 2-(tert-Butylamino)-4-(cyclopropylamino)- 6-(methylthio)-s-triazine(Irgarol 1051), zinc dimethyldithiocarbamate(Ziram), zinc pyrithione(ZnPT), copper pyrihtione(CuPT), 2,2-Dibromo-2-cyanoacetamide( DBNPA), 5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)phenol (triclosan), Ethyl hepatnoate 등이 있다(Park et al., 2006; Rai et al., 2006; Lee et al., 2008). 이와 같은 신 방오제들의 일반적인 방오기작으로는 착생생물에 대해 선택적으로 회 피, 기피 기능을 나타하거나 또는 사멸 시키며, 그리고 착생 생물의 운동성을 저하시켜 결과적으로 착생저하 효과를 나 타낼 수 있다(Zhao et al., 2015).
신방오제 중 Sea-nine 211의 경우 Park et al.(2006)의 연구에서는 조피볼락 Sebastes schlegeli에 대한 급성 독성 연구를 통해 96시간 LC50이 184㎍/ℓ로 나타났고, Diuron 과 Irgarol 1051의 경우도 어류 Pimephales promelas 및 홍다리 얼룩새우 Palaemonetes pugio에 대한 연구들에서 각각 LC50은 182㎎/ℓ, 2.46㎎/ℓ으로 보고되었다(Call et al., 1987; Key, 2008). 또한 해양환경에서 해양식물인 미세 조류와 거대조류는 육상에서 유입된 카드뮴과 같은 중금속 을 흡수하기 때문에 먹이원으로 사용하는 동물체에 축적이 되어 심각한 문제가 야기되고 있다고 보고되었다(Shin et al., 2002). 그러나 대부분의 방오제 연구는 대형 생물의 유 생 및 착생 저서동물에 관한 연구에 집중되어 있는 실정으 로 착생 과정의 기반이 되는 초기 착생 생물에 대한 방오능 검증 연구는 미비한 실정이다.
따라서 본 연구에서는 대표적인 초기 착생 생물인 Ulva pertusa의 포자를 이용하여 신방오제 6종 ziram, diruon, ZnPT, CuPT, DBNPA, triclosan의 포자의 운동성과 착생 저해에 대한 방오능을 검증하였으며, 또한 규조류 Nitzschia pungens를 이용하여 방오능을 검증하였다.
재료 및 방법
1Ulva pertusa 포자의 운동성 저해 검증
운동성 저해 검증 실험을 위해 국내 연안 우점종인 구멍 갈파래를 충남 당진군 한진항(N 36.970264 E 126.781708) 에서 채집하여 아이스박스에 보관한 상태로 실험실로 운반 한 후 멸균 해수(Millipore membrane filter, 0.45㎛)에 넣고 해조체를 분류하였다. 파래에 착생된 생물들을 제거하기 위 해 초음파 처리를 1분 동안 3회 반복한 후 멸균해수로 씻어 음건하였다. 음건된 파래와 멸균해수를 이용해 30분 동안 80μmol/m2/sec의 광도로 20℃ 배양기에서 포자 방출을 유도 하였다(Cho et al., 2001). 방출된 포자를 24 well plate에 접종 하고, dimethyl sulfoxide(DMSO) 농도는 전체의 1000mg/ℓ 로 하였고 신방오제인 ziram, diruon, zinc pyrithione(ZnPT), copper pyrithione(CuPT), DBNPA, triclosan의 농도가 0.1, 1, 5, 10, 100, 1000, 2000㎍/ℓ가 되게 하였으며, 포자의 움직임을 4등급으로 분류하여 광학현미경(BX53, Olympus, Japan)에서 200∼400배에서 검증하였다. 방오제 접종 후 포자의 운동성에 영향이 없는 등급은 ++++으로 표기 하였 고, 95~75% 운동성은 +++으로 표기 하였으며, 74~50% ++, 50% 미만인 경우는 +로 표기하였다.
2미세조류 Nitzschia pungens를 이용한 방오능 검증
방오능 검증을 위해 생체막 형성의 우점종인 N. pungens (KMMCC-803)를 한국미세조류은행에서 분양받아 실험을 수행하였으며 해수와 DMSO를 이용하여 각각의 선정된 신 방오제를 농도별 0, 0.1, 1, 5, 10, 100, 1000, 2000㎎/ℓ로 되게 하였다(Kwon et al., 2012). 각 농도별로 도포된 well 에 f/2 배지를 주입한 후 1.0 × 105cells/㎖의 미세조류를 접종하였다. 배양은 50μmol/m2/s의 광도에서 Light/Dark: 12hr/12hr 조건으로 배양하였고 96시간 배양 후 분광광도계 (UV-1601, Shimazu, Japan)를 사용하여 680㎚에서 optical density(OD)를 측정하였다(Hahm et al., 2002).
3Ulva pertusa 포자를 이용한 방오능 검증
신방오제를 DMSO와 혼합하여 커버글라스에 10㎍/㎠가 되도록 도포한 뒤 24시간 동안 완전 건조 하였다. 신방오제 가 도포된 커버글라스를 well plate에 90°로 고정시킨 후, 1.0 × 105cells/㎖의 파래포자 용액 8㎖을 접종하였으며 암 실에서 정적 상태로 12시간동안 포자착생을 유도하였으며 간섭 착생을 방지하기 위하여 well plate에 착생되지 않은 포자는 멸균 해수로 3회 세척하여 간섭착생을 배제하였다. 세척된 멸균 해수는 PES 배지를 주입 한 후 온도 25℃, 광도 55μmol/m2/sec, Light/Dark:24 hr/0 hr 조건 하에서 6일 동안 배양하였다.
착생 발아된 파래 포자는 역상현미경(CK2, Olympus, Japan)으로 200배에서 관찰하였으며, 커버글라스로부터 완 전히 제거한 후 엽록소 a와b를 추출하여 방오능을 비교하였 다.
Chlorophyll a = 11.93 A664 - 1.93 A647
Chlorophyll b = 20.36 A647 - 5.50 A664
A664 = Absorbance at 664㎚
A647 = Absorbance at 647㎚
결 과
1Ulva pertusa포자의 운동성 저해 검증
신방오제에 대한 파래포자를 이용한 운동성의 경향은 0.1에서 1㎍/ℓ농도에서는 영향이 없는 것으로 나타났으나 ziram, ZnPT는 5㎍/ℓ에서부터 25%의 방오능이 나타났다. 또한 Diruon과 CuPT, DBNPA과 Tricholsan은 10㎍/ℓ에 서 50%으로 착생이 감소하고 100∼1000㎍/ℓ농도에서는 25%의 운동성 저해가 관찰되었다. 신방오제 중 최대 운동 성 저해가 관찰된 것은 Ziram과 ZnPT로 5㎍/ℓ농도에서 50%로, 10㎍/ℓ 농도에서 25%의 착생률 감소로 파래포자 에 대한 착생률을 감소시켰다. 최소 운동성 저해가 관찰된 것은 DBNPA로 1000㎍/ℓ농도에서 25% 운동성 저해로 나 타났으며 2000㎍/ℓ농도에서도 동일한 운동저해를 보였다. 또한 10㎍/ℓ농도가 100㎍/ℓ농도보다 운동성 저해를 25% 더 저해하는 것으로 나타났으며 이러한 경향은 ZnPT에서도 1000㎍/ℓ 농도에서 나타났다.Table 1
2미세조류 Nitzschia pungens를 이용한 방오능 검증
미세조류 N. pungens를 이용한 신방오제의 방오능 검증 을 위해 신방오제의 용매로 DMSO를 사용하기 위해 DMSO 농도에 따른 방오능을 검증하였다. 갈파래의 포자 성장에 영향을 주지 않는 농도를 측정하여 영향이 없는 농도 1,000 ㎖/L에서 실시하였다. 1~10,000㎖/L까지 대조군 대비 성장 률이 약간 증가하거나 대부분 성장의 차이가 없게 나타났으 나 20,000㎖/L에서 성장률이 약 58% 감소하기 시작하여 40,000㎖/L에서는 가장 낮은 성장률을 보였다(Table 2).
일반적인 신방오제의 방오능 검증에서, 방오제의 농도가 높아질수록 상대적으로 N. pungens의 성장률이 낮아지는 것으로 나타났다. Ziram, diuron, ZnPT와 CuPT는 농도 0.1 ∼1㎎/ℓ이하에서 대조군 0㎎/ℓ과 유사한 성장률을 보였 고 신방오제의 농도 5㎎/ℓ부터 성장률 저하(Ziram, 56.9%; Diuron, 59%; ZnPT, 67.2%; CuPT, 52%)를 관찰되었다. 그러나 신방오제 DBNPA는 최대농도 2000㎎/ℓ에서도 N. pungens의 성장률 저해가 관찰되지 않았으며 triclosan 농 도 1000㎎/ℓ에서 N. pungens의 성장률 저해가 관찰되었 다. 신방오제 중 ziram, diuron의 농도 100㎎/ℓ이상에서는 대조군과 비교하여 20% 이하의 성장률을 나타났으며, ZnPT와 CuPT의 경우에도 농도 1㎎/ℓ이하에서 대조군과 비슷한 성장률을 보였고, 5㎎/ℓ부터 성장률 저하(ZnPT, 67.2%; CuPT, 52%)로 나타났고 농도 100㎎/ℓ이상에서는 둘 모두 대조군과 비교하여 20% 이하의 성장률을 나타내었 다. DBNPA는 100㎎/ℓ까지 대조군과 비슷한 성장률을 보 였지만 1000㎎/ℓ에서 5%의 성장률 보였으며 triclosan는 10㎎/ℓ까지 대조군과 비슷한 경향의 성장률을 보이다가 100㎎/ℓ에서 55%의 성장률을 보였으며, 1000㎎/ℓ에서 는 4.8%로 크게 감소하였다.
신방오제 ziram과 diuron의 농도별 N. pungens의 성장률 의 관계에서는 신방오제 농도증가는 성장률억제 패턴으로 모든 대조군과 비교해 강한 성장률 억제를 보였다(ziram : y = -15.988x + 124.82, r2 =0.91, diuron : y = –15.929x + 123.93. r2 =0.91). ZnPT와 CuPT의 농도별 N. pungens 의 성장률의 관계에서는 신방오제 농도증가는 성장률억제 패턴으로 대조군과 비교해 성장률 억제를 보였다(ZnPT : y = -16.048x + 135.71, r2 =0.85, CuPT ; y = -17.488x + 126.99, r2 =0.87). DBNPA와 triclosan은 대조군과 비교 해 1000㎎/ℓ에서 성장률 억제 패턴을 보였다(DBNPA : y = -13.089x + 142.59, r2 =0.41, triclosan : y = -15.536x + 145.54, r2 =0.63).(Figure 1)
방오제 농도와 성장저해에 대한 상관관계는 triclosan과 DBNPA의 농도 1000㎎/ℓ에서 성장률이 급감하기 시작하 는 양상은 Gao et al.(2001)와 Chang et al.(2014)의 미세조 류 Pseudokirchneriella subcapitata와 박테리아 Legionella pneumophila 검증에서도 DBNPA와 triclosan이 고농도에 서 독성이 급격하게 증가한다는 보고 된 적이 있다. 통합적 으로 방오능 양상은 신방오제의 농도가 증가함에 따라 N. pungens의 성장률 저하에 영향을 준 것으로 사료된다 (Figure 2).
3Ulva pertusa 포자를 이용한 방오능 검증
포자 착생 실험에서 방오제의 농도가 증가함에 따라 파래 포자의 착생률이 감소하는 것으로 나타났다. 착생정도를 엽 록소로 대조군(chl a = 1.25㎍/㎖, chl b = 0.64㎍/㎖)과 비 교분석한 결과 ziram의 착생률이 1%(chl a = 0.013㎍/㎖, chl b = 0.043㎍/㎖)로 나타났으며 다음으로는 triclosan로 1.2%(chl a = 0.015㎍/㎖, chl b = 0.022㎍/㎖), diuron 1.8%(chl a = 0.023㎍/㎖, chl b = 0.058㎍/㎖), CuPT 2.7%(chl a = 0.033㎍/㎖, chl b = 0.05㎍/㎖), ZnPT 4.3%(chl a = 0.054㎍/㎖, chl b = 0.072㎍/㎖) 순서로 방오 능을 보였다. 특히 DBNPA의 방오능은 대조군(100%, chl a = 1.25㎍/㎖, chl b = 0.64㎍/㎖)과 비교하면 78%(chl a = 0.975㎍/㎖, chl b = 0.37㎍/㎖)의 착생률을 나타냈다 (Figure 3). 신방오제 중 최대방오능은 ziram과 triclosan으 로 각각의 착생률이 1%(chl a = 0.013 ㎍/㎖), 1.2%(chl a = 0.0151㎍/㎖)로 나타났다. 이러한 결과는 신방오제의 방오능이 U. pertusa의 운동성에 영향을 주어 착생률이 감 소된 것으로 사료된다.(Figure 4)
고 찰
신방오제의 방오능에 대한 일반적인 양상은 방오제의 농 도가 증가할수록 초기 착생 생물인 구멍갈파래 포자와 미세 조류에 대한 방오능이 증가하는 것으로 나타났다. DBNPA 는 U. pertusa 와 N. pungens에 대한 포자운동성과 방오능 은 미비한 반면 ziram은 5㎍/ℓ에서 포자운동성 감소가 시 작하여 10㎍/ℓ에서 포자의 운동성이 최저점으로 감소하였 다. 또한 ziram과 ZnPT가 10㎍/ℓ에서 타 신방오제 비해 높은 방오능 나타났고, 100㎍/ℓ에서는 DBNPA와 Triclosan 을 제외한 나머지 방오제의 경향이 유사한 것으로 나타났 다.
신방오제의 방오능 50% 이상의 효과를 보이는 농도를 비교하였을 때, CuPT은 1㎎/ℓ, ziram과 diuron, ZnPT는 5㎎/ℓ로 비슷한 양상을 보였고, DBNPA와 triclosan는 100 ㎎/ℓ으로 방오제 농도별 차이를 보였다. U. pertusa를 이용 한 착생 저해효과에서는 ziram을 이용하였을 때 착생률이 1%로 나타났으며 N. pungens를 이용한 방오능 검증 실험 에서는 ZnPT와 CuPT의 농도 5㎎/ℓ에서 67.2%, 52%를 나타났다. Girling et al.(2015)의 연구에서 Ulva sp.의 포자 에 대한 diuron의 성장 저해 검증 결과, 본 연구결과 양상과 같이 방오제의 농도가 증가함에 따라 포자의 성장이 저해되 는 양상이 나타났다. 방오제의 농도에 따라 구멍갈파래 포 자의 운동성 및 착생률에 영향을 미치는 것으로 나타났으며 본 연구를 통해 대표적인 초기 착생생물인 거대조류 U. pertusa와 미세조류 N. pungens에 대한 상용 신방오제 검증 의 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다. 향후 연구 를 통하여 물리화학적인 연안생태계를 고려하여 다양한 초 기 착생생물을 대상으로 신방오제에 대한 방오능 검증이 이루어져야 될 것으로 사료된다.
