서 론
중금속의 경우 폐광산 내의 광산폐석이나 차량의 운행이 많은 도로, 교량 등에 축적되어있던 것들이 유출수나 강우 에 의해 주변의 토양이나 수계, 농경지 등으로 유입되어 생 태계에 영향을 나타낸다(Kim et al., 2005; Kim and Lee, 2005; Lee et al., 2006). 농약의 경우 농경지의 수로나 유량 이 적은 계류 등을 선호하고 매년 일정한 장소에서 번식 및 산란을 하는 습성을 가진 양서류에게 노출될 경우 매우 치명적이며 배아가 농약과 같은 환경오염물질에 노출될 경우 배발생 이상, 성장저해, 사지형성 이상 등의 기형이 발생하는 것으로 보고되었다(Wassersug, 1975; Henle, 1981; Nebeker et al., 1994; Choi et al., 2002).
Zn의 경우 결핍이 일어나면 생식소 발달, 감수분열 과정 등에 높은 확률로 기형이 발생할 수 있으며, 과량의 아연이 노출될 경우에는 신경세포에 영향을 미치는 것으로 보고되 었다(Bedwal and Bahuguna, 1994; Dineley et al., 2010). 또한, 양서류의 경우 Xenopus laevis에서 과량의 아연에 노 출되었을 때 다양한 기형이 유발되는 것으로 보고되었다 (Luo et al., 1993)
Benomyl의 경우 염색체의 구조적 변화, 정소의 기능억 제, 단백질합성 저해, 신경세포 분화 등의 기능에 관여하는 것으로 알려져 있으며(Zelesco et al., 1990; Lim et al., 1997; Marinovich et al., 1996; McLean et al., 1998)도롱뇽(Hynobius leechii) 배아에 노출시켰을 때 유사분열억제 및 tubulin 중 합 억제, microubulin 파괴와 신경배, 신경습 폐쇄 등에 의 해 배아 및 유생의 발달을 저해하는 것으로 보고되었다 (Choi et al., 2002).
이러한 유해화학물질들이 환경에 미치는 유해성평 가를 위해 물벼룩(Bernot et al., 2005; Movahedian et al., 2005), 어류(Doleželová et al., 2008; Richter et al., 2011), 포유류(Stout et al., 2009; Korani et al., 2011) 등의 실험동물을 사용한 만성 및 급성 독성평가가 이 루어지고 있으며 Xenopus laevis의 배아를 활용한 Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus(FETAX) 방법이 넓은 범위에서 사용되고 있다 (Fort et al., 1988; Bantle et al., 1990; Presutti et al., 1994; Morgan et al., 1996).
최근 여러 국가에서 해당 지역 내 서식하고 있는 양서 류의 배아를 활용한 독성평가 시험법 연구가 활발히 진행 되고 있으며(Gutleb et al., 1999; Loumbourdis et al., 1999; Mann and Bidwell, 2000; Lance et al., 2012) 우리나라에서 도 청개구리(Ko, 2012), 참개구리(Ko, 2012), 북방산개구 리(Ko, 2006), 무당개구리(Kang et al., 2004), 도롱뇽(Choi et al., 2002) 등의 배아를 활용한 독성평가 연구가 진행된 바 있다.
본 연구에서는 국내에 서식중인 개구리 중 넓은 지역에 분포하며 산란시기가 빠르고 채집이 용이한 두꺼비(Bufo gargarizans)를 대상으로 지금까지 알려지지 않았던 두꺼 비 배아의 정상발달과정을 확립하고 두꺼비 배아를 이용하 여 FETAX 시험방법에 따라 최기형성물질로 알려진 Zn(Luo et al., 1993)과 농약류인 Benomyl(Choi et al., 2002)에 의 한 치사율, 기형율, 기형양상, 성장에 미치는 영향 등의 효과 를 확인하고 이를 통해 화학 물질 및 환경오염물질의 독성 평가 가능 여부를 알아보고 화학 물질 및 환경오염물질의 유해성을 평가할 수 있는 기법으로 활용하고자 한다.
재료 및 방법
1.시험동물
시험에 사용된 두꺼비는 2015년 2월~3월까지 광주 전남 일대에서 번식 시기에 포접 중인 두꺼비 암 ․ 수 성체를 직접 채집하여 사용하였다.
2.배양액 제조
Amphibian Ringer 용액(AR; 6.6g/ℓ NaCl, 0.15g/ℓKCl, 0.15g/ℓ CaCl2, 0.2g/ℓ NaHCO3, 0.05g/ℓ Streptomycin, 0.03g/ ℓ Penicillin G)을 제조하여 pH 7.4로 맞추어 사용하였다.
3.수정란 채취 및 배양
포접중인 두꺼비 암 ․ 수 5쌍을 광주광역시 광산구 인근에 서 채집하여 실험실에서 자연 배란 및 수정과정에 의해 2세포의 배아들이 출현하기 시작하면(Johnson and Volpe, 1973; Mathews, 1986) 2세포 배아들 중 세포질들이 정확히 나누어져 균일한 할구들을 가진 배아들을 선택하여 예리한 포셉으로 젤리층을 제거하고 20±1℃에서 포배기까지 배양 하여 시험에 사용하였다.
4.정상발생과정 조사
직경 100㎜의 유리 배양접시에 시험물질이 첨가되지 않 은 배양액 60 ㎖에 30개의 배아를 배양하면서 2세포에서 올챙이의 꼬리지느러미 순환시기까지 진행되는 정상발생 과정과 각 발생단계에 소요되는 시간 등을 조사하였다. 배 양과정 중 24시간마다 새로운 배양액으로 교환하면서 배양 하였다.
5.시험물질 처리(Zn, benomyl)
배아의 발달에 미치는 영향을 보기 위해 사용했던 Zn은 1,000 ppm Stock solution(Zinc nitrate, Zn(NO3)2‧6H2O, Junsei Chem.)을 구입하여 사용하였으며 Benomyl(Methyl [1-[(butylamino)carbonyl]-1H-benzimidazol-2-yl]carbama te Methyl 1-(butylcarbamoyl)-2-benzimidazolecarbamate, C14H18N4O3, 농업진흥청 제공)은 DMSO에 녹여 1,000ppm Stock solution으로 제조한 후 이를 AR용액으로 희석하여 사용하였다. 유리 배양접시에 시험물질이 농도별로 포함된 실험군과 시험물질이 포함되지 않는 대조군의 배양액 10 ㎖에 낭배기까지 배양된 배아들을 각 농도별로 10개씩 넣 고 20±1℃의 온도에서 120시간 배양하였다. 시험물질은 매 24시간마다 새로운 용액으로 교환하였다. 시험물질의 농도 는 Zn 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50㎎/ ℓ, Benomyl 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25 ㎎/ℓ로 정하 여 실시하였고 모든 농도구간에 대해 각기 다른 개체에서 채취한 배아들을 사용하여 3회 이상 반복 시험하였다.
6.결과처리 및 분석
각 농도별 치사율은 24시간마다 관찰하여 죽은 것을 제 거하였고 120시간 후 생존된 것을 3% Formalin에 고정하 고, 이들 고정된 개체들을 대상으로 기형 개체 수 및 양상을 조사하였다. 그 결과들을 (죽은 개체/노출 개체)×100으로 계산하여 한 농도의 치사율을 구하였다. 기형율은 120시간 배양 후 생존한 유생들을 대상으로 개체당 머리, 복부 및 꼬리 등 각 부위별로 기형 여부를 조사하였다. 정상적인 Tadpole의 범위에서 벗어나면 기형으로 판정하였으며 120 시간 후 생존한 개체 중 (영향을 받은 개체/영향을 받지 않 은 개체)×100으로 계산하여 한 농도의 기형율을 구하였다. 치사율과 기형율 값을 대상으로 Probit analysis Program을 활용하여 LC50, EC50을 구하였으며 아울러 LC50 값을 EC50 값으로 나누어 Teratogenic Index(TI)를 구하고 TI 값이 1.5 이상이 되면 최기형성이 있는 물질로 판정하였다(Bantle and Courchesne, 1985). 기형의 종류는 정상발생 올챙이를 기준으로 머리의 형성이나 안구 등에 이상이 나타난 경우 머리(Head)기형으로 판정하였고 복부의 돌출현상 등을 관 찰하여 복부(Abdomen)기형으로 판정하였다. 또한 몸 전체 또는 일부에 수포가 형성되거나 부풀어 오른 경우 수포형성 기형(Edema)으로 판정하였으며 두 가지 이상의 기형이 관 찰되는 경우 복합(Propound)기형으로 판정하였다(Bantle et al., 1998). 배아의 발달과정과 시험물질이 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해 AM-423x와 Dinocapture 2.0 프로그 램(ANMO)을 사용하여 배아의 직경 및 유생의 머리끝부터 꼬리 끝까지의 전 체장의 길이를 측정하였다.
결 과
1.배아발달과정
포접 중인 암컷에서 자연배란된 난자는 평균 13,000여개 정도였으며 난자의 직경은 1.8±0.1㎜정도였다. 2세포기 배 아는 수정 후 대략 3시간 경과 후에 나타나기 시작하여 32 세포기까지 대략 1시간 간격으로 난할이 진행되었으며 직 경이 1.8±0.1㎜정도였다. 이후 배아는 난할이 진행되어 상 실배가 되기까지 약 12시간이 소요되었으며 포배기까지는 17시간 정도 소요되었다. 실험에 사용된 낭배기의 배아는 수정 후 약 25시간 가량 경과 후에 확인 할 수 있었다. 배아 의 크기는 신경습(neural fold) 단계까지 1.8±0.1㎜로 유지 되다가 신경관(neural tube) 단계에서는 직경이 다소 증가하 여 2.2±0.1㎜ 정도의 크기를 나타냈으며 수정이후 신경관 이 완성되는 시기까지 약 55시간 정도를 필요로 했다. 이 시기에는 기관형성(organogenesis)이 일어나는 것으로 알 려져 있다. 올챙이의 기본적인 형태를 갖추는 미아시기에는 배아의 직경이 급격히 신장되어 2.9±0.1㎜정도의 크기를 나타냈으며 수정 후 약 65시간 정도가 소요되었다. 배아의 운동성이 관찰되기 시작하는 시기인 근육반응시기에는 배 아의 전장이 4.1±0.1㎜ 정도까지 성장하였으며 수정 후 약 76시간 정도 경과 후 관찰되기 시작하였다. 이후 미아가 점차 신장하여 신경관을 비롯하여 체절성 중배엽, 척색, 기 습 등의 구조가 나타나는 심장박동기를 거쳐 머리 부분과 꼬리부분의 구분이 뚜렷해지고 겉아가미가 관찰되기 시작 하는 아가미순환시기에는 전장의 길이가 6.2±0.3㎜ 정도였 으며 발달까지 약 90시간 정도가 소요되었다. 유생이 꼬리 지느러미를 움직여 헤엄치는 것이 가능한 꼬리지느러미 순 환시기에는 전장이 7.2±0.3㎜ 정도까지 성장하였으며 수정 후 대략 105시간 가량이 소요되었다. 아가미구멍에 의해 열려있는 점막의 주름을 갖는 아가미 뚜껑주름시기에는 유 생의 전장이 9.1±0.5㎜정도로 성장하였으며 수정 후 대략 124시간 정도가 소요됐다. 완전한 올챙이의 모습을 갖추게 되는 아가미 닫힘 시기까지는 약 145시간이 소요되었으며 이시기 배아의 전장은 10.8±0.7㎜를 나타냈다(Figure 1).
2.두꺼비 배아 발달에 미치는 Zn의 효과
두꺼비의 배아 발생에 미치는 Zn의 효과를 알아보기 위 해 낭배기까지 배양된 배아들을 Zn이 첨가되지 않는 대조 군과 Zn 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50㎎/ℓ를 각각 처리하여 120시간 배양 후 치사율 및 기형 율, 기형양상 등을 조사하였다. 1 ㎎/ℓ에서 5.0%의 죽는 배아들이 나타났다. 10 ㎎/ℓ의 농도에서는 37.5%의 배아가 치사하는 것으로 나타났으며 25 ㎎/ℓ이상의 농도에 노출된 배아들은 모두 치사된 것으로 확인되었다(Figure 2. A). 기 형은 0.1 ㎎/ℓ에서부터 5.0% 배아들에서 나타나기 시작하 였으며 0.5, 1, 5, 10 ㎎/ℓ로 농도가 높아지면서 15.0%, 21.1%, 76.3%, 80.0%로 그 비율이 증가하였다(Figure 2. B). 두꺼비의 배아에 대한 Zn의 LC50은 10.3으로 나타났고 EC50은 2.3, TI는 4.4를 나타내었다(Table 1).
Zn의 영향에 의해 나타난 기형의 종류는 머리기형, 복부 기형, 수포형성기형, 복합기형 등을 나타내었다. 이들의 비 율을 농도별로 살펴보면 0.1㎎/ℓ의 농도에서는 소수의 개 체에서 복합기형만이 관찰되었다. 0.5㎎/ℓ에서는 머리기 형, 복부기형, 복합기형 등 다양한 기형양상을 나타냈으며 머리기형이 50%로 가장 높게 관찰되었고 이어 복합기형 (33.3%), 복부기형(16.7%)의 순으로 나타났다. 1㎎/ℓ의 농도에서는 머리기형과 복합기형의 비율이 62.5%, 37.5% 의 비율로 나타났으며 5㎎/ℓ에서는 머리기형이 3.5%, 수포 형성기형 44.8%, 복합기형 51.7%로 복합기형의 비율이 가 장 높게 나타났다. 10㎎/ℓ에서는 수포형성기형과 복합기형 의 비율이 각각 30.0%, 70.0%로 나타났다(Figure 2. C). 배아의 성장에 미치는 영향을 조사한 결과 대조군(10.8±0.7 ㎜)에 비해 Zn 0.001, 0.01, 0.1, 1㎎/ℓ의 농도에서는 10.8±0.9, 10.9±1.1, 10.8±1.3, 10.7±1.6㎜로 유지되다가 5, 10 ㎎/ℓ에서는 10.3±1.1, 10.0±1.0㎜로 감소하여 나타났다 (Figure 2. D).
3.두꺼비 배아 발달에 미치는 Benomyl의 효과
두꺼비의 배아 발생에 미치는 Benomyl의 효과를 알아보 기 위해 Benomyl이 전혀 포함되지 않은 대조군과 Benomyl 을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25 ㎎/ℓ가 포함된 시험군을 각각 처리하여 120시간 배양 후 배아들에게 나타난 치사율 과 기형율, 기형양상, 배아의 전장(total length) 등을 조사하 였다. 5 ㎎/ℓ에서부터 죽는 배아들이 16.8%의 비율로 나타 나기 시작하였으며 10, 25 ㎎/ℓ으로 농도가 높아짐에 따라 치사율도 86.8, 100%로 증가하였다(Figure 3. A). 기형은 0.5 ㎎/ℓ에서부터 10.0%의 배아들에서 나타나기 시작하였 으며 기형율도 1, 5 ㎎/ℓ으로 농도가 높아짐에 따라 그 비율 이 16.7, 100%로 증가하였다(Figure 3. B). 두꺼비의 배아 에 대한 Benomyl의 LC50은 6.9를 나타내었고 EC50은 1.0을 나타내었으며 TI는 6.7을 나타내었다(Table 1). Benomyl의 영향에 의해 발생된 기형의 종류는 복부기형과 복합기형을 나타내었으며 복합기형의 비율이 높게 나타났다. 이들의 비 율을 농도별로 살펴보면 EC50을 나타내는 농도보다 낮은 1 ㎎/ℓ의 농도에서는 복부기형의 비율이 높았고 LC50과 가 까운 농도인 5 ㎎/ℓ으로 농도가 높아지면서 복합기형의 비 율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 3. C). 배아의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해 체장을 비교한 결과 대조군(10.8±0.7㎜)에 비해 Benomyl의 농도가 1, 5, 10㎎/ ℓ로 증가함에 따라 유생의 체장은 10.7±1.1, 6.8±0.5, 4.0±0.5㎜로 감소하여 나타났다(Figure 3. D).
고 찰
두꺼비(B. gargarizans)는 전국에 널리 분포하는 것으로 알려져 있으며 10~11월경 동면을 시작해 이듬해 2~3월 에 동면에서 깨어나 활동과 동시에 번식에 접어들어 물이 고인 농경지 및 웅덩이, 저수지 등에 산란 및 번식을 한다 (Yang et al., 2001; Lee et al., 2011). 본 연구에서 두꺼비의 자연배란을 통해 수정란을 채취하고 얻어진 배아들을 통해 두꺼비의 발생과정 및 배양조건 등을 확립 할 수 있었다 (Figure 1). 두꺼비에서 나타나는 유생의 발달단계는 Rana pipiens (Johnson and Volpe, 1973; Mathews, 1986), X. laevis(Deuchar, 1972)의 발달단계와 매우 유사한 경향을 나타내었다. 암컷 두꺼비 1개체에서 배란되어진 난자는 약 13,000개 정도였으며 대부분의 배아들이 수정되어 난할과 정이 정상적으로 진행되어 시험에 활용 가능한 배아들이 다량으로 확보가 가능했으며 배양이 용이하여 화학물질에 대한 독성을 평가하는데 좋은 시험재료로 사용 될 수 있음 을 확인하였다.Figure 4
Zn의 효과를 시험 결과 1㎎/ℓ에서 치사된 배아들이 나 타나기 시작하였으며 25㎎/ℓ이상의 농도에서는 모든 배아 가 치사하였고 5, 10, 25㎎/ℓ으로 농도가 높아지면서 치사 된 배아들의 비율도 5.0%, 37.5%, 100%로 증가하여 나타 났다. 또한 Benomyl의 시험결과 5㎎/ℓ에서부터 죽는 배 아들이 16.8%의 비율로 나타나기 시작하여 10, 25㎎/ℓ으 로 농도가 높아지면서 86.8%, 100%로 비율도 각각 증가하 여 Zn과 Benomyl 모두 농도에 의존하여 치사율이 증가하 는 경향을 나타냈다. 체장의 경우 Zn의 시험 결과 대조군 (10.8±0.7㎜)에 비해 농도가 1, 5, 10㎎/ℓ로 증가함에 따라 유생의 체장은 10.7±1.6, 10.3±1.1, 10.0±1.0㎜로 감소하였 으며 Benomyl의 시험결과도 대조군(10.8±0.7㎜)에 비해 농 도가 1, 5, 10㎎/ℓ로 증가함에 따라 유생의 체장은 10.7±1.1, 6.8±0.5, 4.0±0.5㎜로 감소하여 나타났다. 시험물질의 농도 가 증가함에 따라 치사율이 증가하고 유생의 체장이 낮게 나타나는 현상들은 시험에 사용했던 Zn과 Benomyl 모두 두꺼비 배아의 생존 및 성장에 있어 유해하게 작용한 결과 로 해석되어지며 FETAX 기법을 적용한 Zn과 Benomyl에 의한 기형성지수(Teratogenic Index, TI)가 1.5이상인 4.4, 6.7로 계산되어 시험물질 모두 두꺼비 배아에 있어 최기형 성을 갖는 것으로 나타났다(Bantle and Courchesne, 1985). 따라서 Zn 과 Benomyl 모두 두꺼비 배아발달에 최기형성 물질로 작용하는 것으로 나타났다. 한편, Zn과 Benomyl의 영향에 의해 나타난 기형의 종류는 Zn의 경우 머리기형, 복부기형, 수포형성기형, 복합기형 등이 나타났고 Benomyl 의 경우 복부기형, 복합기형 등이 나타났으며 이들은 Zn과 Benomyl의 농도에 의존하여 그 비율도 증가하였다. 본 연 구의 결과들을 기존의 보고와 비교해보면 Zn의 경우 X. leavis의 배아에 노출된 경우 수포형성기형(Edema), 복부기 형(Cardiac, gut), 척추기형(notochord), 머리기형(eye, facial) 등으로 본 실험과 유사한 결과를 나타냈으며, LC50 850μ㏖(ZnCl2), 12.8㎎/ℓ(Zn), 56.4㎎/ℓ(ZnSO4), EC50 40μ㏖(ZnCl2), 8.5㎎/ℓ(Zn)의 값을 나타냈다. 또한, TI는 21(ZnCl2), 1.5(Zn)로 두꺼비의 결과와 같이 최기형성 물질 로 작용하였다(Luo et al., 1993; Martini et al., 2013).
Benomyl의 경우 도롱뇽(H. leechii)에 노출했을 때 머리 기형(무두증, 두부형성부전), 복부기형(삼각형의 몸통, 땅땅 한 체형), 수포형성기형(복부수포형성, 가슴수포형성), 척추 기형(옆으로 휜 꼬리) 등이 확인되었으며 1μ㏖이상의 농도 에서는 모든 배아가 치사하는 것으로 보고되었다(Choi et al., 2002). 무당개구리의 경우 꼬리기형, 복합기형, 복부기 형, 척추기형, 수포형성기형의 유형을 나타냈으며 100㎎/ℓ 의 농도에서 모든 배아가 치사하는 것으로 나타나 두꺼비에 비해 높은 농도에서 치사되는 것을 확인할 수 있었다(Ko, 2011). 청개구리의 경우 꼬리기형, 복부기형, 머리기형, 복 합기형의 유형을 나타냈으며 LC50 2.59㎎/ℓ, EC50 0.68㎎/ℓ, TI 3.81로 두꺼비 배아보다 낮은 농도에서 영향을 받는 것 으로 사료되며 최기형성물질로 작용함을 확인하였다(Ko, 2013).
이상의 결과들로 보아 Zn과 Benomyl은 모두 치사율, 기 형율, 기형양상, 성장에 미치는 영향 등이 농도에 따라 비율 이 증가하고 체장이 감소하여 배아의 발달과정에 유해하게 작용하였으며 각각의 문헌결과와 비교하였을 때 배아발달 에 유사한 양상을 나타내 두꺼비 배아를 활용한 화학물질의 독성평가시험기법은 신뢰성을 확보한 것으로 생각되며 화 학물질 및 환경오염물질에 대한 독성평가에 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
