서 론

국제적으로 생물다양성의 감소가 다양한 지역에서 문제 화 되고 있으며(IUCN Red List, 2014), 양서류 개체군의 감소 및 몇몇 종들의 멸종들이 1980년을 기점으로 환경변 화에 민감한 양서류 분류군의 특성과 생태계에 미칠 수 있 는 심각성을 고려하여 국제적인 관심을 받아 왔다(Park et al., 2014). 양서류 감소를 유발하는 요인으로는 서식지의 파괴 및 교란, 개체들의 남획, 오염물질노출 등과 더불어 기후변화에 따른 감염성 질병의 증가가 꾸준히 거론되어 왔다(Ducatez and Shine, 2016). 비록 서식지의 파괴가 가 장 큰 양서류 감소의 요인임에는 분명하지만, 최근에는 특 별히 감염성 질병에 연구의 관심이 집중되고 있다(Daszak et al., 1999; Rachowicz et al., 2006). 감염성 질병은 무미 류와 유미류 항아리곰팡이에 의한 개체군의 절멸이 유럽, 아프리카, 남미, 동남아시아 등 거의 전 세계적으로 보고되 면서 현재는 가장 활발하게 연구되고 있는 야생질병들 중의 하나가 되었다(Rachowicz et al., 2006; Petersen et al., 2016). 최근에는 항아리곰팡이병에 대한 국내 연구도 시작 되어 국내의 지역적 분포 및 양서류 종에 따른 감염률에 대한 보고들이 이루어져 왔다(Yang et al., 2009; Jeong et al., 2010; Bataille et al., 2013; Fong et al., 2015). 항아리 곰팡이 병 이외에도 붉은다리증(red-leg disease)이나 라나 바이러스(ranavirus)와 같이 많은 양서류 개체들을 한 번에 죽여 양서류 개체군의 절멸을 일으킬 수 있는 다른 질병들 역시 보고되고, 연구되어 왔다(Densmore and Green, 2007). 국내에서도 개구리 양식장에서 붉은다리증과 라나바이러 스로 인한 개체들의 사망이 보고된 바 있다(Kim et al., 2008; Kim et al., 2009). 이러한 질병이외에 상대적으로 양서류의 대량 사망을 유도하지는 않지만, 다양한 선충, 구 두충, 거머리와 같은 내·외부 기생충들 역시 중간 혹은 최종 숙주로서 양서류를 이용하는 것으로 알려져 있다(Hong et al., 1985; Densmore and Green, 2007; Park, 2012; Sim et al., 2012; Jeong et al., 2014). 위에서 언급한 대량사망을 유발하는 질병들 이외의 다양한 질병에 대한 국내연구는 매우 미비한 상황이며(Kim et al., 2013), 특별히, 기생충 감염의 사례와 더불어 기생충 감염을 양서류 생태학적 관점 에서 연구한 예는 전혀 없는 실정이다.

국내에는 2005년 2월년부터 야생동·식물보호법에 의거 해 산개구리 3종(북방산개구리 Rana dybowskii, 계곡산개구 리 Rana huanrenensis, 한국산개구리 Rana coreana)이 판매 목적을 위한 양식이 허가되어 있다(Ministry of Environments, 2005). 양식장을 운영하기 위해서는 환경부에서 제시한 양 식장 위치, 면적, 울타리 규격 등의 조건을 따라서 시설을 갖추어야 한다(Ministry of Environments, 2005). 법적으로 양서류의 양식이 허가되는 것을 계기로 국내의 다양한 지역 에서 개구리 양식장이 운영되어 왔으며, 현재도 몇몇 곳에 서 양식장이 운영되고 있다. 위에서 언급한 것처럼 양식장 시설허가 기준은 환경부가 제시한 반면, 개체관리 및 질병 관리와 같은 구체적인 운영에 관한 규정은 제시하고 있지 않아, 적지 않은 양식장에서 질병으로 인한, 개구리 폐사의 문제점을 겪고 있으며, 개별 양식장 별로 질병관리를 시행 하고 있다. 특별히, 개구리 양식장의 경우 밀식사육에 따라 양식된 개구리들의 기생충을 비롯한 질병감염의 우려, 양식 된 개구리 소비자의 질병 감염우려와 더불어 다양한 감염성 질병의 양식장 인근 야외 양서류 개체군으로 전파의 위험성 을 가지고 있다(Mazzoni et al., 2003; Miller et al., 2009; Najiah et al., 2009). 이러한 현 실정에도 불구하고 개구리 양식장을 대상으로 한 발병하는 질병의 연구 및 기생충 감 염 연구는 매우 미비하여, 이에 대한 대안 연구가 시급한 실정이다.

구두충은 머리에 입을 가지는 것처럼 보이는 구문(proboscis) 을 가지며, 영명으로는 가시머리벌레(thorny- or spiny-headed worm)로 불리는 기생충이다(Petrochenko, 1971; Crompton and Nickol, 1985). 국제적으로 약 1150여종이 알려져 있으 며, 국내에서는 현재까지 3종이 보고되어 있다(Yu, 1986; Kim, 1998; Kim et al., 2001; Jeon, 2006; Kang et al., 2013). 구두충은 윤충류(rotifer)에 분류학적으로 가까우며, 머리 앞의 구문을 이용하여 숙주생물의 소화관 벽에 붙거나 소화관 벽을 뚫고 이동하는데 이용하며, 영양분은 체표를 통해서 흡수한다(Crompton and Nickol, 1985). 구두충의 크기는 작게는 몇 ㎜로부터 크게는 65㎜에 이른다. 구두충 은 생활사를 완성하기 위하여 적어도 두 번 이상의 서로 다른 숙주를 이용하는데, 1차 숙주로는 연체류, 특히 달팽이 와 같은 무척추동물들을 이용하며, 2차 숙주로는 어류, 양서 류, 파충류 등이 알려져 있으며, 최종숙주로는 조류와 포유 류를 이용한다(Crompton and Nickol, 1985). 구두충의 연 구는 분류학적인 연구들이 여전히 주를 이루고 있으며 (Bush et al., 2009; Amin, 2013; Tkach et al., 2013; Amin et al., 2015), 국내에서도 명태, 대구, 참돔, 드렁허리, 유혈 목이 등으로부터 구두충이 보고되었으며(Shin and Shim, 1984; Kim et al., 2001; Jeon, 2006; Kim et al., 2011; Kang et al., 2013), 감염된 동물들에서 나타나는 소화관과 관련된 조직이상이나 염증 역시 보고되어 있다(Kang et al., 2013). 사람에게서 발견된 구두충으로는 약 8종이 보도되어 있으 며, 소화관 문제의 원인이 될 수 있을 것으로 생각되나, 병리 적인 예는 알려져 있지 않다(Sahar et al., 2006; Haustein et al., 2010). 국내에서 양서류와 파충류의 양식이 허가되면 서, 이들이 구두충을 포함하는 다양한 기생충에 감염될 수 도 있으나, 연구가 미비하며, 특별히 양서류에서 구두충의 감염 여부는 알려져 있지 않아, 이에 대한 연구가 필요한 상황이다.

본 연구에서는 국내 네 곳의 개구리 양식장 내·외부에서 채집된 북방산개구리의 구두충 감염률, 감염 개체수, 감염 신체부위를 비교분석하였으며, 더불어 북방산개구리를 감 염시킨 구두충의 종류를 속(genus) 단위까지 동정하여 제시 하였다.

연구방법

1.북방산개구리로부터 구두충 표본수집 및 형태학 적 분류

북방산개구리의 번식기인 2015년 3-4월 사이 인제, 괴산, 공주, 보령에 위치한 개구리 양식장으로부터 북방산개구리 를 채집하였다. 인제(양식장 내부에서 수컷 6, 암컷 5; 양식 장 외부에서 수컷 7, 암컷 2)와 괴산(내부에서 수컷 6, 암컷 4; 외부에서 수컷 9, 암컷 1) 양식장의 경우 양식장 내부와 외부에서, 공주(수컷 8, 암컷 2)와 보령(수컷 10)의 경우 양 식장 내부에서만 북방산개구리를 채집하였다. 채집한 개체 는 실험실로 이동시켜 MS222 1.0%에 과마취 시켜 죽였으 며, 해부현미경 밑에서 해부를 통해 체강, 위, 소장, 대장으 로부터 구두충을 채집하고, 그 수를 기록하였다. 채집된 구 두충은 지역, 개체별로 구분하여 70% ETOH 혹은 10% 중 성 포르말린에 고정시켰다.

구두충을 북방산개구리들로부터 채집한 결과 구두충들 은 성체의 형태를 갖춘 유생단계인 acanthella 혹은 cystacanth 단계에 있었으며, 원형을 유지하고 있거나, 구문이 나와 소 화관 벽에 부착되어 있었다(Figure 1B). 대부분의 경우 핀 셋을 이용하여 구두충을 누르는 경우 구문이 부분적 혹은 전체적으로 나와 형태적 관찰이 가능하였다. 구두충들의 분 류에서 매우 중요한 분류키가 되는 구문에 위치한 가시의 행과 열의 수로 구분할 때, 적어도 2종이상이 있을 것으로 우선 판단하였다(Figure 2A,B; Bhattacharya, 2007). 그러 나 한 종류의 경우 전체 개체들 중 2마리만이 발견되었으며 (Figure 2B), 관찰을 위한 표본의 제작과정에서 표본이 변 형되어, 추가적으로 정확한 형태관찰이나 분자생물학적인 연구를 수행할 수 없었다. 이 종류의 구두충에 대해서는 추 가로 내용에서 언급하지 않았다. 그리하여, 2마리를 제외한 나머지 개체수로 구성된 1종류의 구두충들만을 대상으로 형태 및 분자생물학적 연구를 수행하였다.

구두충의 외형관찰을 위하여 Amin et al. (2014)의 방법 을 따라서 염색과 투명화 작업을 수행하였다. 고정된 구두 충을 24시간 동안 흐르는 물에 세척한 후 Mayer’s acid carmine (Amin et al., 2015)방법으로 염색을 하였으며, 이 후 자일렌(xylene)과 캐나다발삼(Canadian balsam)액을 1:1로 혼합한 용액에 24시간 처리하고 최종적으로 캐나다 발삼 액에 샘플을 홈이 파인 슬라이드에 위치시켰다. 제작 된 슬라이드는 해부현미경과 광학현미경을 이용하여 관찰 하였다. 구두충의 형태적 관찰에서는 4마리의 구두충에서 구문(proboscis)의 가시 유형과 돋아난 가시의 횡과 열의 개수, 구문주머니(proboscis sheath)의 형태, 구문 가분절 (pseudosegmnet)의 유무, 수곤(lemniscus)의 형태, 내부골 격(lacunar system), 정낭(testis), 시멘트선(cement gland)의 형태와 수 등을 기록하였다(Figure 2C,D). 제작된 표본이 완전하지 못하여 4마리의 구두충에서 모든 자료들이 공통 적으로 기록할 수 없어, 기술통계분석을 실시하지는 않았 다. 얻어진 자료와 이전 문헌들을 이용하여 구두충을 형태 적으로 분류하였다(Petrochenko, 1971; Bhattacharya, 2007; Amin et al., 2015).

2.구두충의 분자생물학적 분류

구두충 1마리로부터 DNA의 추출은 DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 수행하 였으며 DNA 추출 전에 보관액으로 사용되었던 70% 에탄 올의 제거를 위하여 10분간 3차 증류수로 세척 후 수행하였 다. 개체의 종을 확인하기 위하여 이전 연구결과(Amin et al., 2015)에 근거하여 핵의 18S rRNA의 염기서열을 사용 하였다. 해당 서열의 PCR 증폭을 위하여 이전 연구에서 사용되었던 프라이머(5′-AGA TTA AGC CAT GCA TGC GTA AG-3′와 5′-TGA TCC TTC TGC AGG TTC ACC TAC-3′)를 사용하였다(Near et al., 1998). PCR 반응은 SimpliAmp Thermal Cycler (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 95℃에서 4분간 반응시키고, 95℃ 에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 90초 동안 반응시키 는 과정을 35회 반복하였으며, 72℃에서 10분간 최종적으 로 반응시켰다. PCR 산물은 염기서열결정에 들어가기 전에 AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer, Daejeon)를 사 용하여 정제하였으며, 염기서열결정은 PCR 반응에서 사용 한 프라이머와 같은 프라이머로 마크로젠 염기서열 서비스 (Macrogen, Seoul)에 의뢰하여 3730xl DNA analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 진행하였다.

계통수 작성을 위하여, 얻어진 염기서열은 Bioedit software package (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) 를 이용하여 정리하여 최종적으로 18S rRNA 부분 서열을 획득하였다. 이 서열을 유전자 데이터베이스(NCBI, http://www. ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLAST하여 기존 보고된 서열들과 비교를 통하여 계통수 분석에 사용할 서열을 결정하였다. 본 실험과 GeneBank에서 얻은 18S rRNA 서열들은 ClustalX ver. 2.1 (Larkin et al.,2007)을 이용하여 정렬하였고 PAUP* v4.0b10 (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, UK)과 Modeltest Ver. 3.7 (Posada and Crandall, 1998), MrBayes v3.1.2 (Huelsenbeck and Ronquist, 2001)를 이용하여 Maximum Likelihood (ML) 계통수를 작성하였 다. 계통수 작성 시 10,000번의 Bootstrap을 실시하여 신뢰 성을 확인하였으며 likelihood 조건들은 Modeltest에서 얻 은 결과를 사용하였다.

3.자료의 통계분석

자료의 분석에서 우선, 개구리의 건강지수와 전체 및 체 강, 위, 소장, 대장 내 구두충 수와의 관련성을 Spearman 상관분석으로 분석하였다. 암수 간, 양식장 내‧외부 간, 양식 장들 간 전체 및 체강, 위, 소장, 대장 신체 부위 간 감염된 개구리 수(감염률)의 비교는 Fisher exact test를 이용하여 분석하였다. 감염의 정도를 나타내는 구두충 수의 암수 간, 양식장 내‧외부 간의 비교는 Wilcoxon signed rank test를 이용하여 분석하였으며, 양식장들 간 전체 및 체강, 위, 소 장, 대장 내에서 발견된 구두충 수의 비교는 Kruskal-Walis test를 이용하였으며, 사후검증은 Siegel and Castellan (1988)의 방법을 따랐다.

결 과

1.구두충의 형태적, 분자생물학적 분류

구두충의 몸통은 원통형이며, 중-후반부의 너비가 가장 크다. 구문은 두 부분으로 구분되어지는 경계면을 가지는 것처럼 보이는데(가분절), 앞부분은 타원형이 반으로 잘린 형태이고, 뒷부분은 원통형이다(Figure 2A,C,D). 구문주머 니는 이중벽을 가지며 구문의 중간 경계부터 내부로 뻗어있 다(Figure 2C). 구문의 길이는 전체 몸통길이의 약 1/4에 해당하며, 너비는 몸통의 가장 좁은 부분과 유사하다. 구문 의 중간 경계 윗부분에는 30-33행에 7-9열, 몸통 쪽인 아랫 부분에는 29-31행에 3-4열의 가시가 있어, 전체적으로는 29-33행에 11-13열로 가시가 나 있다(n=2). 구문 끝 쪽인 경계 앞부분의 가시는 가시와 체표의 각이 105-111°(평 균,108°)인 반면, 뒷부분의 가시 각도는 127-128°(평균 127.6°)로 차이가 있다. 수곤은 구문주머니의 양쪽 옆으로 2개가 있다(Figure 2C). 그러나 신경절이 명확히 관찰되지 는 않았다. 몸통에는 내부골격이 구문주머니의 아래로부터 2줄 이상으로 몸통의 전체를 통과해 위치한다(Figure 2D). 수컷 2개체에서 정소가 관찰되었는데, 타원형으로 수곤의 끝부분으로부터 멀지 않은 몸통의 앞쪽에 치우쳐 있다. 시 멘트선은 가는 튜브 형태로 관찰되었으며, 3-4개가 있었다. 정소를 가지지 않는 개체들은 암컷으로 판단하지만, 명확하 게 발달되어 있는 알이 관찰되지는 않았다.

국내 북방산개구리에서 발견된 대표적인 구두충 개체의 18S rRNA 염기서열을 이용한 계통수 작성에는 Echinorhynchida 목에 속하는 Centrorhynchidae 과 3종, Polymorphidae 과 10종으로 이루어진 구두충 13종의 18S rRNA 서열이 사용 되었으며 외군으로 Polymorphida 목에 속한 구두충 2종의 18S rRNA 서열이 사용되었다(Figure 3). ML 계통수를 작 성할 때 Modeltest를 통하여 분석된 Likelihood 값은 Lset Base=(0.2645 0.2157 0.2712), Nst=6, Rmat=(1.0000 3.5674 1.0000 1.0000 5.7913), Rates=gamma, Shape=0.8091, Pinvar=0.4202였다. 분석 결과를 기초로 계통수를 작성하 였고 Bayesian 분석을 통하여 사후 확률을 구하여 계통수의 신뢰성을 평가하였다. 그 결과, Figure 3과 같이 6개 그룹으로 나타났다. 그룹 A에는 Corynosoma 속 3종과 Andracantha 속 1종이 가까운 근연관계를 보였고 그룹 B에는 Bolbosoma 속 2종, 그룹 C에는 Pseudocorynosoma 속 2종, 그룹 D에서 는 Southwellina hispida와 Polymorphus brevis가 가까운 근 연관계를 보였다. Polymorphidae 과로 이루어진 그룹 A, B, C, D는 Centrorhynchidae 과와 북방산개구리에서 발견 된 구두충 G525CS로 이루어진 그룹 E와 F는 서로 확연히 분화된 그룹을 이루고 있어 G525CS는 Centrorhynchidae 과에 속한다는 것을 보였다(Figure 3). 또한 G525CS는 Centrorhynchus conspectus 사이에서 그룹 F를 형성하여 동 일한 속에 속하는 C. microcephalus나 C. globirostris보다 근연한 관계를 보였다. 그리하여, 채집된 구두충은 Centrorhynchus 속에 속하는 종으로 최종 결정하였다.

2.북방산개구리의 구두충 감염률과 감염 개체 수

위에서 언급한 것처럼, 1종류 이상의 구두충이 발견되었 으나 한 종류의 경우 2마리만이 발견되었기 때문에, 감염률 이나 감염정도의 비교에서는 종류를 구분하지 하지 않고, 자료를 처리하였다. 연구된 북방산개구리 60개체들 중 31 마리로부터 적어도 1마리 이상의 구두충이 발견되었으며, 전체적으로 51.7%의 구두충 감염률을 보였다. 신체부위별 로는 개체의 중복을 허용하여 헤아릴 때, 7마리의 체강, 25 마리의 위, 16마리의 소장, 9마리의 대장에서 구두충이 발 견되어, 위의 구두충 감염이 가장 높은 것으로 확인되었다.

북방산개구리의 건강지수와 발견된 전체 구두충 수, 신체 부위인 위, 소장, 대장 각각에서 발견된 구두충수 사이의 상관분석의 결과 개구리의 건강지수는 전체 구두충 수, 체 강과 위 내의 구두충 수와는 음의 상관(P<0.05)을 보인 반 면, 소장과 대장 내의 구두충 수와는 유의한 상관이 없었다 (P>0.05, Table 1). 더불어 위 내의 구두충 수는 각각 체강, 소장, 대장 내의 구두충 수와 양의 상관(P<0.05)을 보인 반 면, 체강의 구두충 수와 소장과 대장 내의 구두충 수와는 유의한 상관이 없었다(P>0.05). 소장과 대장 내의 구두충 수는 양의 상관(P<0.05)을 보였다(Table 1).

양식장 내부와 외부에서 채집된 개체들의 구두충 감염률 을 비교한 결과, 내부에서 채집한 41마리 중 24마리 (58.5%), 외부에서 채집한 19마리 중 7마리(36.8%)가 감염 되어 내부에서의 구두충 감열률이 다소 높았지만 통계적으 로 유의한 차이는 아니었다(P=0.166). 또한, 신체부위별 감 염률에서도 체강(P=0.086), 위(P=0.779), 소장(P=0.066), 대장(P=0.99) 어느 부위에서도 양식장 내부와 외부 간에 유의한 차이가 없었다. 양식장 내부(35.7±2.9)와 외부 (36.2±3.0)에서 채집한 개체들 사이에 건강지수는 차이가 없었으며(P=0.386), 감염된 구두충의 수 정도의 비교에서 도 전체 구두충 수나 신체 부위별(체강, 위, 소장, 대장) 어느 것에서도 양식장 내부와 외부 간에서 유의한 차이가 없었다 (P>0.05, Figure 4A).

북방산개구리 암수 개체의 구두충 감염률을 비교한 결과, 수컷이 조사된 45마리 중 26마리(57.8%), 암컷이 15마리 중 5마리(33.3%)로 수컷의 감염률이 다소 높았지만, 통계 적으로는 유의한 차이가 없었다(P=0.139, Figure 4B). 또한, 암수의 신체부위별 감염률 비교에서도 체강(P=0.176), 위 (P=0.071), 소장(P=0.516), 대장(P=0.678) 어디 부위에서도 차이가 없었다. 비록 암컷의 건강지수가 53.3±5.8(n=15)로 수컷의 30.1±1.3(n=45)보다 유의하게 컸지만(P<0.01), 암 수 간 감염된 구두충 수의 비교 결과, 전체 구두충 수나 신체 부위별(체강, 위, 소장, 대장) 구두충 수에 있어 어느 것에서도 유의한 차이가 없었다(P>0.05, Figure 4B).

인제, 괴산, 공주, 보령 네 양식장 사이의 북방산개구리 구두충 감염률을 비교한 결과 괴산(55%), 공주(80%), 보령 (90%)의 감염률이 인제(15%) 보다 유의미하게 높았으나 (P<0.05), 괴산, 공주, 보령의 세 양식장 사이에는 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 신체부위별 감염률을 양식장 간에 비교해 보면, 체강의 경우 공주와 보령의 감염률이 인제와 괴산보다 높았으며(P>0.05), 위와 소장의 경우 괴산, 공주, 보령의 감염률이 인제보다 높았다(P<0.05). 대장의 경우 괴 산이 인제보다 감염률이 높았으나(P<0.05) 다른 지역들 간 의 차이는 유의하지 않았다(P>0.05, Figure 5A). 양식장 간 개 체들의 건강지수 비교에서 인제(51.9±4.4)가 괴산(31.6±1.5), 공주(25.5±1.7), 보령(22.9±1.3)보다 건강지수 값이 유의하 게 컸으나(P<0.01) 괴산, 공주, 보령 간의 차이는 유의하지 않았다(P>0.05). 확인된 구두충의 수 정도의 비교에서, 전 체 구두충 수, 체강, 위, 소장에서 발견된 구두충 수는 양식 장 간 유의한 차이가 있었지만(P<0.05), 대장에서 발견된 구두충 수는 양식장간 유의한 차이가 없었다(P>0.05, Figure 5B). 사후검증에서, 전체 구두충 수는 괴산, 공주, 보령이 인제보다 많았으나(사후검증 P<0.05), 세 지역 상호 간의 차이는 유의하지 않았다(사후검증 P>0.05). 위의 경우 보령 에서 발견된 수가 인제보다 특별히 많았다(사후검증 P<0.05). 이 이외의 다른 비교는 어느 것도 유의한 차이가 없었다(사후검증 P>0.05).

고 찰

국내에서 개구리 양식장 내 북방산개구리들의 구두충 감 염정도를 파악하기 위하여 네 곳의 양식장으로부터 북방산 개구리를 채집하여, 구두충을 확인하고 양식장 간, 암수 간, 양식장 내·외부 간, 신체 부위별 감염률과 감염정도를 비교 연구하였다. 연구결과 지역에 따라 차이는 있지만 평균 51.7%의 북방산개구리가 구두충에 감염되어 있었으며, 감 염된 구두충은 Centrorhynchus 속에 속하는 구두충으로 판 명되었다. 구두충의 감염과 북방산개구리의 건강지수는 상 호관련성을 보였으며, 위가 다른 내부 장기보다 감염률이 높았다. 양식장 중에서 인제가 특별히 감염률이 낮았으나, 양식장 전체에서 암수와 양식장 내·외부 간에는 차이가 없 었다. 우리의 연구는 Centrorhynchus 속의 구두충이 국내 양서류도 감염시킨다는 최초보고이며, 운영 중인 개구리 양 식장에서 질병의 관리 및 효율적인 양식을 위한 자료로 활 용될 것으로 판단된다.

북방산개구리에서 기생하는 구두충은 Centrorhynchus 속인 것으로 나타났다. 구두충은 세계적으로 약 1150여종이 보고되 었으며, 이들 중에서 Centrorhynchus 속은 Centrorhynchidae 과에 속하는데, 이 속에 속하는 구두충들은 구문에 가분절 을 가지며 정단부에는 뿌리를 가진 가시가, 후단부에는 뿌 리가 없는 가시를 가진다(Petrochenko, 1971; Bhattacharya, 2007). 더불어서 구문 위의 가시는 16-48열을 가지며, 각 열은 8-40개의 가시로 구성되며, 신경절은 구문주머니의 중 간 부위에 위치한다. 또한, 수곤은 가늘고 길며, 정소는 몸통 의 앞부분에 위치하며, 시멘트선은 3-6개의 길고 가는 형태 를 보인다. 북방산개구리로부터 채집된 구두충은 경계면을 가지는 구문, 구문주머니의 이중벽, 수곤, 내부골격, 가는 관형태의 시멘트선, 앞으로 치우친 정소의 위치 등의 특징 을 보이고 있는데, 이는 앞에서 언급한 Centrorhynchus 속 의 특징과 일치되는 것이다. 이 Centrorhynchus 속의 구두 충은 국내에서도 기록된바가 있는데, 이전의 연구들(Shin and Shim, 1984; Choi et al., 2010) 역시 수곤의 구조, 구문 위 29-33개의 가시 열과 각 열 내에 12-13개의 가시, 구문의 이중벽, 튜브형의 시멘트선 등의 특징을 근거로, 구두충들 을 Centrorhynchus 속으로 분류한 바 있다. 이러한 형태적 인 특징에도 불구하고, 최종숙주를 확인하지 못하였기 때문에 구두충의 성체를 확인할 수 없다는 한계점으로 인하여 종을 결정할 수는 없었다. 우리의 18S rRNA의 계통분류를 이용한 결과 역시, 본 연구에서 확인된 구두충이 Centrorhynchus 속 에 속한다는 것을 보여주고 있다. Maximum likelihood 분 석 결과는 우리나라 북방산개구리에서 발견된 구두충이 다 른 과 혹은 다른 속과의 근연관계에 비하여 Centrorhynchus 속의 종들과 밀접한 근연관계를 보여 Centrorhynchus 속임을 제시한다. 그러나 현재까지 구두충, 특히 Centrorhynchidae 과를 대상으로 축적되어 있는 유전정보의 자료가 다른 분류 군들에 비하여 상대적으로 매우 적고, 구두충의 18s rRNA 의 전체 시퀀스를 얻는 것이 어려워 전체의 약 41.5%인 727bp만을 이용하여 계통분류를 한 것은 추가로 개선되어 야할 부분이다. 다양한 구두충 종들의 유전적 정보가 축적 이 된다면, 분자생물학적인 정보를 이용하여 종의 결정을 좀 더 용이하게 할 수 있을 것으로 생각된다. 야생동물 질병 에 대한 연구가 증가하고 있는 국제적인 국내적인 추세를 고려할 때, 형태적인 분류뿐만 아니라, 유전적 정보를 이용 한 구두충 분류 역시 국내에서 연구가 시급한 것으로 판단 된다.

구두충은 국내에서 양식 대상 양서류인 북방산개구리를 중간숙주로 이용하는 것으로 나타났다. 구두충은 일반적으 로 절지류 특별히 절지류를 1차 숙주로 하고, 어류, 양서류, 파충류를 2차 숙주로, 포유류와 조류를 최종숙주로 한다 (Crompton and Nickol, 1985). 국내에서 구두충은 명태, 참 돔, 대구, 드렁허리 등의 어류와 파충류인 유혈목이에서 보 고된 바 있다(Shin and Shim, 1984; Kim et al., 2001; Jeon, 2006; Choi et al., 2010; Kang et al., 2013). 특별히, 본 연구에서 확인된 Centrorhynchus 속의 구두충은 1984년 유 혈목이에서 최초 보고되었으며, 쥐 실험을 통해서 이들이 위벽을 뚫고 체강으로 이동할 수 있는 것으로 알려져 있다 (Shin and Shim, 1984; Choi et al., 2013). Centrorhynchus 속의 구두충이 국내 양서류를 중간숙주로 한다는 것이 이번 연구에 서 최초로 확인되었다. 양서류를 중간숙주로 하는 구두충으로 는 연구에서 확인된 속인 Centrorhynchus와, Eehinopardalis, Pseudoacanthocephlaus, Acnathocephalus, Polymorphus, Pomphohynchus 등이 알려져 있다(Bhattacharya, 2007). 국 내 양서류 기생충을 연구한 Kim(1993)의 연구결과에 따르 면, 국내 서식하는 대부분의 양서류에서 구두충이 기생한다 는 것을 보고한 것을 고려할 때, 본 연구에서 확인된 Centrorhynchus 속의 구두충이 다른 양서류 종 내에서도 기생할 수 있음을 시사한다. 추가적인 파충류와 특별히 양 서류들에서 Centrorhynchus 속의 구두충의 중간숙주로서 의 역할을 규명할 필요가 있다.

북방산개구리의 구두충 감염은 유생 및 성체시기에 주로 섭식과정을 통해서 이루어질 질것으로 판단된다. 즉, 위로 유입된 구두충은 Choi et al. (2013)의 연구에서 알려진 것 처럼 북방산개구리의 소화관을 따라 이동하거나, 위 혹은 소화관 벽을 뚫고 체강으로 이동이 가능한 것으로 나타났 다. 명확히 구두충이 어떠한 경로를 따라서 북방산개구리를 감염시켰을 지는 현재 단계에서 결정하는 것은 가능하지 않다. 북방산개구리들이 수생에서 올챙이 시기를 보내고, 성체들은 육상에서 생활함을 고려할 때, 올챙이 시기에 감 염된 물이나, 유기물, 무척추동물의 사체로부터 감염될 수 있을 것이다. 특별히, 구두충의 알들이 물을 따라 이동하여, 연못이나 개울에 다다라 직접감염 혹은 수서 무척추 연체류 1차 숙주를 통한 감염이 가능할 것이다. 반면, 북방산개구리 성체들이 육상생활 동안 구두충의 중간숙주가 되는 다양한 곤충류 및 절지류를 먹이로 하며(Lee and Park, 2016), 북방 산개구리 성체들의 나이가 4-9세 정도일 것임을 고려할 때, 감염된 먹이를 통한 성체의 감염 역시 가능한 경로가 된다. 특별히, 위의 감염률이 가장 높고, 위의 감염률이 소장과 대장의 감염률과 높은 상관을 보인다는 신체부위별 감염률 을 고려할 때, 구두충이 먹이의 섭식과정에서 개구리로 유 입된다는 것은 매우 가능성이 높아 보인다. 소화관의 감염 후 일부 유충들은 소화관 벽을 뚫고 나와 벽의 상피에 고정 되어 있거나, 벽으로부터 떨어져 체강에서 구두충이 발견된 것으로 보인다. 양서류의 성체와 유생의 구두충 감염을 비 교연구 하여 구두충의 양서류 감염경로를 밝히는 것은 1150여종의 구두충이 보고되었지만, 25종정도의 생활사만 규명되어 있는 것을 고려할 때(Crompton and Nickol, 1985), 의미 있는 연구가 되리라 본다.

북방산개구리 구두충의 감염은 양식장 격리 시설 및 성별 에 영향을 받지 않는 것으로 보인다. 우리의 연구에서 북방 산개구리 암수 간과 양식장 내 ‧ 외부 간 구두충 감염률에서 차이를 보이지 않았다. 양식장 내부에서는 일반적으로 올챙 이나 성체에게 상업용 먹이를 제공하는 것을 고려할 때, 주 된 먹이원 보다는 격리된 양식장 시설에도 불구하고 내‧외 부 모두에서 이용 가능한 먹이원을 통해서 구두충이 감염되 었을 것을 암시한다. 더불어, 일반적으로 양식장 인근의 수 원을 양식장 수원으로 사용하는 것을 고려할 때, 구두충이 있는 수원으로부터 직접 감염되거나 수원으로부터 감염된 절지류를 섭취함으로서 이루어질 것으로 생각된다. 암수 간 에 구두충 감염률에 차이가 없다는 것은 구두충의 감염이 암수의 서로 다른 신체적 특징에 영향을 받지 않는 다는 것을 암시한다.

양식장의 환경조건은 구두충 감염과 관련이 있을 것으로 생각된다. 인제 양식장의 북방산개구리들의 경우 구두충 감 염률이 15%로 다른 지역에 비하여 상대적으로 낮았다. 괴 산 북방산개구리의 경우 양식장 내‧부 간 유사한 각각 60% 와 50% 구두충 감염률을 보였고, 비록 양식장 내부 개체만 연구되었지만 공주와 보령의 경우는 각각 80%와 90%의 감염률을 보였다. 양식장이 저지대이며 온화한 기후 조건을 가진 공주와 보령의 구두충 감염률은 인제보다 유의미하게 높았으며, 비록 통계적으로는 차이가 없었지만, 고지대의 산간에 위치한 괴산에 비해서도 역시 구두충 감염률이 높았 다. 이러한 경향은 감염된 개체로부터 발견된 구두충 수의 비교에서도 동일한 결과가 나타났다. 그럼에도 불구하고, 이러한 양식장 간 구두충 감염률과 정도의 차이가 양식장 간의 북방산개구리 관리수준의 차이로 유발되었는지, 북방 산개구리 채집 시기의 차이로 유발되었는지, 아니면, 인제 라는 상대적으로 높은 위도로 인한 낮은 온도와 같은 환경 조건의 차이로 유발되었는지는 불분명하다. 추가적으로 다 양한 지역에서 많은 양식장과 많은 야외 개체군을 대상으로 연구를 수행하여야 답을 얻을 수 있을 것으로 생각된다.

북방산개구리의 건강지수와 구두충 감염률이 높은 상관 을 보인다는 것은 구두충 감염이 북방산개구리에 미치는 영향을 예측케 한다. 양서류에서 몸무게를 몸통길이로 나누 어 도출하는 건강지수는 개체의 정상성장, 영양분 섭취, 활 동성 등을 포함하는 개체의 건강상태를 대변하는 지수이다. 본 연구에서 건강지수가 낮은 개체들이 더 많은 구두충을 가지고 있다는 것은 건강지수 악화로 낮아진 면역력이 기생 충의 감염을 촉진했을 수 있다고 볼 수 있다. 반대로 건강지 수가 낮은 개구리들의 구두충 감염의 정도가 높은 것이, 구 두충의 감염이 개구리들의 건강지수를 낮추었기 때문에 관 련성이 있을 수도 있다. 이전연구들에서 구두충에 감염된 드렁허리를 포함하는 어류에서 점막상피 충혈, 염증반응, 기생충성 육아종, 위 불편 등의 증세를 보였으며, 식욕감퇴 및 무기력 역시 유발하는 것으로 알려져 있다(Bayoumy et al., 2006; Jeon, 2006; Mehlhorn, 2008; Kang et al., 2013). 만약 구두충이 북방산개구리에서 같은 증상을 유도한 다면, 구두충의 감염은 북방산개구리의 건강지수를 악화시키는 요인들 중의 하나로 작용할 수 있을 것이다. 높은 비율로 양식중인 북방산개구리들이 구두충에 감염되어 있음을 고 려할 때, 양식장 운영의 효율을 높인다는 측면에서도 구두 충 감염에 따른 개체 영향에 대한 추가 연구가 필요하다.

종합하면, 우리의 연구결과는 국내에 양식 중인 북방산개 구리들이 구두충에 높은 비율로 감염되어 있으며, 감염의 정 도는 중남부 지역의 환경조건 혹은 북방산개구리의 건강지수 와 관련되어 있는 것으로 나타났다. 감염된 구두충은 형태적 특징과 18S rRNA 염기서열 비교를 근거로 Centrorhynchus 속에 속하는 구두충으로 판단되었다. 현재 연구결과로부터 구두충 감염의 경로는 분명하지는 않지만, 수원 및 먹이원 을 통한 감염이 가능할 것으로 생각되며, 시기 역시 유생인 올챙이와 성체 시기 양자 모두 가능할 것으로 보인다. 이전 연구의 결과들처럼, 구두충의 감염이 양식 중인 북방산개구 리의 소화관에 문제를 일으키고, 이것이 식욕감퇴로 건강지 수의 저하와 같은 개체의 건강이 악화되는 경우, 이어지는 면역력의 약화로 추가적이 기생충의 감염 및 다른 주요 질 병인 라나바이러스와 같은 개체군 절멸을 일으키는 질병에 걸릴 확률 역시 높일 수 있을 것으로 보인다. 그리하여, 양식 장 개구리들의 기생충 감염 정도와 감염이 이루어지는 경 로, 감염으로 인한 개체의 영향 등에 대한 추가적인 연구를 좀 더 많은 양식장을 대상으로 수행하여, 양식 양서류들의 질병감염을 낮추어 양식의 효율을 높이고, 인접 야외개체군 으로 가능한 질병의 전파를 낮추어야할 것으로 판단된다.