서 론

나문재속(Suaeda)은 명아주과(Chenopodiaceae), 나문재 아과(Spirolobeae)에 포함되는 식물군이다. 나문재속 식물 은 두 가지 유형의 서식 분포를 나타내고 있는데, 극지방에 서 열대까지의 조간대 습지, 강하구, 해변과 온대 및 아열대 지역의 알카리성 평원이나 염분이 있는 호수가나 내륙사막 에 분포한다(Alvarado and Flores-Olvera, 2013;Brandt et al., 2015). 전 세계적으로 약 110여 종이 분포하고 있는 것으로 알려져 있다(Schütze et al., 2003).

한반도의 서･남해안은 갯벌이 잘 발달되어 나문재속 식 물이 널리 분포하고 있다. 나문재(S. glauca (Bunge) Bunge), 칠면초(S. japonica Makino), 해홍나물(S. maritima(L.) Dumort) 등은 한국산 나문재속으로 기재되어 있으며(Chung, 1957), 좁은해홍나물(Suaeda heteroptera Kitagawa)은 Park(1974)에 의한 최신보고 이후 더 이상 기술되지 않고 있다. 방석나물(S. australis (R. Br) Moq)은 Chung(1992) 에 의해 한반도 미기록 종으로 보고되었으며, 기수초(S. malacosperma Hara)는 Shim et al(2001)에 의해 한반도 미기록종으로 추가되었다. 따라서 한국산 나문재속은 문헌 기록 상 6종으로 보고되어 있으나 최근 기록에서 나타나지 않고 있는 좁은해홍나물을 제외하고 5종이 분포하는 것으 로 제시할 수 있다(Chung, 1992;Chung and Lee, 1995;Shim and Choi, 2004;Lee et al., 2007). 이들 중 형태적으 로 뚜렷한 특징을 보이고 있는 나문재는 Sect. Schanginia (C.A.Mey.) Iljin에 속하며, 칠면초, 해홍나물, 방석나물, 기 수초등은 Sect, Heterosperma Iljin에 포함된다(Iljin, 1936). 나문재속 식물들은 형태적으로 매우 유사하여 식별하는데 어려움이 있다. 또한 카스피해 주변에 서식하고 있는 Sect, Heterosperma Iljin에 포함된 S. crassifolia Pall, S. salsa (L.) Pall. 및 S. prostrata Pall.도 식별에 큰 어려움을 보이고 있으며 S. maritima (L.) Dumort의 아종으로 취급하기도 한다(Freitag and Lomonosova, 2006). 나물재속 종들의 일 부는 Freitag et al(1996), Lomonosova and Freitag(2003)등 에 의해 식별을 위한 연구가 이루어졌지만, 대부분은 개체 식별, 분포 및 생태에 관한 연구가 불충분한 실정이다. 한반 도에 서식하고 있는 칠면초, 해홍나물, 방석나물, 기수초 등 은 형태적으로 유사하고, 개체 식별의 주요 형질인 가지의 분지형태, 잎의 모양, 열매의 모양 등이 종내 개체간에도 상당한 변이를 보이고 있어 식별에 어려움이 있는 것으로 알려져 있다(Shim et al., 2001).

DNA 바코드는 짧고 표준화된 DNA 영역의 염기서열을 기반으로 생물 종을 확인할 수 있는 유용한 방법이다 (Hebert et al., 2003). 식물은 엽록체에서 추출된 여러 영역 이 식물 바코드로서 보편적으로 개체식별에 대한 유용성이 연구되었다(Kress and Erickson, 2007;Fazekas et al., 2008). CBOL Plant Working Group (2009)은 rbcl + matK 의 조합을 육상식물의 핵심 바코드로 제안하였으며, Yao et al(2010)은 ITS2 영역을 식물과 동물에 모두 사용할 수 있는 바코드로 제안하였다. rbcl + matK 핵심 바코드가 일 부 소수 종에 대한 연구를 토대로 제안된 것을 보완하기 위해 psbA-trnH 영역에 대한 평가가 수행되었다(China Plant BOL Group1, 2011). 한국산 나문재속에 대한 DNA 바코드 연구는 Shim(2005)에 의해 ITS 염기서열이 분석 되었으며, Lee et al(2007)에 의해 ITS 염기서열과 psbBpsbH 염기서열의 영역이 분석되어 한국산 나문재속의 계통 관계에 관한 연구가 이루어졌음에도 불구하고 여전히 나문 재속 식물에 대한 계통관계가 명확하다고 할 수 없다.

따라서, 본 연구는 한반도에 서식하고 있는 나문재속 식 물을 대상으로 핵 리보솜 DNA(nrDNA) ITS 구간의 염기서 열과 엽록체 DNA(cpDNA) matK, psbA-trnH 및 trnL-trnF 구간의 염기서열 분석을 통해 분류군간 계통학적 위치를 파악하고자 하였다.

연구방법

1. 연구대상

본 연구는 2016년부터 2017년 사이 우리나라 서해안 갯벌 에서 채집한 나문재속 5종을 재료로 사용하였다. 나문재(S. glauca)는 2개 지역, 칠면초(S. japonica)는 7개 지역, 해홍나 물(S. maritima)은 2개 지역, 방석나물(S. australis)은 6개 지역, 기수초(S. malacosperma)는 2개 지역에서 채집 하였 으며 총 21개의 시료를 분석하였다(Table 1). 본 연구 기간 중에 채집된 개체는 Shim(2005)에 의한 형태학적 분류 특징 에 따라 동정하고, 석엽표본으로 제작하여 국립수산과학원 갯벌연구센터 표본실에 확증표본으로 소장하였다.

2. Genomic DNA 추출

DNA 추출에 사용한 시료는 액체질소를 사용하여 급냉 한 후 막자사발을 이용하여 분말상태로 마쇄한 후 분말 100mg을 취하여 1.5mL Eppendorf tube에 넣어 Accuprep ®GMO DNA Extraction Kit(Bioneer, Korea)제품의 방법 에 따라 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 1% 아가로스 겔(STRATAGENE AgaroseⅠ, USA)에서 전기영동하고 Ethidium Bromide(EtBr)로 염색하여 DNA 절편을 확인하 였다. DNA의 순도와 농도는 분광광도계(ATI Unicam Ltd, UK)를 사용하여 260nm와 280nm에서 흡광도를 측정하여 정량하고, 각각의 농도를 20ng/㎕로 희석하여 PCR 반응에 사용하였다.

3. 유전자 부위 PCR 증폭 및 염기서열 분석

약 20ng/㎕의 total DNA를 주형으로 각각의 primer (Table 2) 및 HiPi Plus DNA Polymerase (ELPIS-Biotech, Korea)를 최종 20㎕의 반응용액에 첨가하여 SimpliAmp Thermal Cycler(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 증폭은 95℃에서 30초, 57~60℃에서 30초 72℃에서 60초 반복하여 30Cycle을 진 행하였다. 반응이 끝난 증폭산물은 1.2% 아가로스 겔 상에 서 증폭 여부를 확인하고 단일 DNA 절편으로 확인된 증폭 산물은 Accuprep®Gel Purification Kit(Bioneer, Korea)를 이용하여 정제 회수한 후 염기서열 결정에 사용하였다. 염 기서열은 ABI PRISM 3700 GENETIC analyzer(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 확보하고 시료의 표준염기 서열로 선정하여 분석하였다.

4. 계통학적 분석

각 시료의 염기서열은 BioEdit 프로그램(version 7.2.5) 을 이용하여 편집하고 ClustalW Multiple alignment로 정렬 하여 비교 분석하여 계통분석이 가능한 DNA 염기서열을 탐색하였다(Thompson et al., 1994). 전체 분석대상 시료의 유연관계 분석은 21 개체의 각 DNA 바코드 구간 전체 염기 서열과 GenBank에 등록된 나문재속의 염기서열 정보를 검 색하여 비교하였다. 계통수 작성에 사용된 외군(Outgorup) 은 GenBank에서 Patellifolia patellaris의 염기서열을 다 운받아 사용하였으며 각각의 accession number는 ITS (LK054290.1), matK(LK054319.1), psbA-trnH(LK054368.1) 그리고 trnL-trnF(AY858603.1)이다. 계통유전학적 거리 측 정을 위해 MEGA6 프로그램의 Maximum Likelihood 방법 으로 통계처리 하였으며, Bootstrap 분석을 1,000회 반복하 여 bootstrap value를 산출하고 염기서열 정렬과정에 나타 나는 gap은 모두 사용하여 분석하였다. 일관성지수(CI)와 보존지수(RI)는 Maximum Parsimony 분석방법을 사용하 였으며, 초기 계통수 작성은 MCL(Maximum Composite Likelihood) 접근법을 사용하여 추정 된 쌍 거리 행렬에 Neighbor-Joining(NJ)방법을 적용하였다.(Tamura et al., 2013).

결 과

1. DNA 바코드 구간 증폭

한국산 나문재속 5종 21개체를 식물의 계통분석에 유용 하게 사용되는 DNA 바코드인 ITS, matK, psbA-trnH 및 trnL-trnF 영역을 증폭한 결과, 모든 시료에서 균일하게 증 폭되었으며 각각의 바코드 영역 PCR 증폭효율은 100%로 나타났다. 각각 예상되는 크기의 DNA 절편은 약 ITS 650bp, matK 800bp, psbA-trnH 350bp 그리고 trnL-trnF 400bp로 아가로스 겔 전기영동을 통하여 확인하였다. 각 시료에 대한 염기서열을 분석하여 최종 확정된 바코드 영역 의 유전자 증폭산물의 크기는 ITS 영역에서 나문재, 칠면 초, 방석나물, 해홍나물, 기수초에서 629bp로 동일하였다. matK 영역의 증폭산물은 798bp~803bp였다. psbA-trnH 영 역은 350bp~363bp 크기로 나타났으며, trnL-trnF 영역은 368bp~409bp 크기였다(table 3).

2. 염기서열 변이양상

한국산 나문재속 5종의 염기서열은 BioEdit 프로그램 (version 7.2.5)을 이용하여 편집하고 ClustalW Multiple alignment로 정렬하여 비교 분석하였다. ITS 영역의 염기서 열 변이양상은 정렬된 염기서열의 크기는 640bp였으며, 이 중 117bp의 염기서열이 변이를 보였으며 변이율은 18.28% 이었다. 보존된 염기서열은 523bp로 나타났으며 구아닌과 시토신(G+C 함량)은 56.88%이었다. matK 영역의 염기서 열 변이양상은 정렬된 염기서열의 크기는 804bp이고 변이 양상을 보이는 염기서열은 32bp로 변이율은 3.98%로 가장 낮은 변이율을 보였으며, 보존된 염기서열은 772bp이었다. matK 영역의 G+C 함량은 31.92%로 나타났다. psbA-trnH 영역의 염기서열 변이양상을 보면 정렬된 염기서열의 크기 는 363bp로 나타났으며 이중 보존된 염기서열은 348bp이 고 변이를 보이는 염기서열은 15bp로 가장 적은 수의 변이 를 보였으나 변이율은 4.13%이었고, G+C 함량은 27.02% 이었다. trnL-trnF 영역의 염기서열 변이 양상은 정렬된 염 기서열의 크기는 412bp였으며, 47bp의 염기가 변이를 보이 고 있으며 변이율은 11.41%이었다. 365bp의 염기가 보존 된 상태를 보였고, G+C 함량은 30.37%이었다(Table 3).

3. 종간 유연관계 분석

한국산 나문재속 5종 21개체의 ITS, matK, psbA-trnH 그리고 trnL-trnF 바코드 영역 각각의 염기서열과 NCBI database에서 Blast-search를 통해 확보한 지중해 서부 및 북아프리카에 서식하는 명아주과 식물인 Patellifolia patellaris의 염기서열을 외군(outgroup)으로 사용하여 종간 유연관계를 분석한 결과 ITS 영역에서 bootstrap value(BP) 는 71~100%로 나타났으며 나문재가 독립적으로 그룹을 형 성하였다. 방석나물과 해홍나물이 하나의 그룹을 형성하고 기수초 계통과 가장 가까운 유연관계를 보였으며, 칠면초와 해홍나물이 하나의 그룹으로 묶인 계통과 비교적 가까운 유연관계가 나타났다. ITS 영역을 분석한 나문재속은 4개 의 계통을 형성하는 것을 확인하였으며(Figure 1A), tree length는 231이고 MP tree의 일관성지수(CI)는 0.978, 보존 지수(RI)는 0.978이었다. 따라서 칠면초, 해홍나물, 방석나 물, 기수초 4종이 유전적으로 가깝게 형성되고 있으며 나문 재는 타 4종에 비해 상당한 유전적 차이를 보이고 있다. matK 영역의 유연관계 분석 결과 79~100%의 BP가 나타났 으며, 칠면초와 방석나물이 93%의 BP로 각각 그룹을 형성 하고 나문재와 해홍나물이 BP 94%로 유전적으로 가깝게 그룹을 형성하였으며 기수초는 칠면초, 방석나물과 유전적 으로 가깝게 그룹을 형성하는 것을 확인 하였다(Figure 1B). matK 영역의 tree length는 110이고 MP tree의 일관성지수 는 0.963, 보존지수는 0.964로 나타났다. psbA-trnH 영역의 종간 유연관계 분석에서 BP는 80~99%로 나타났으며 기수 초가 독립적으로 하나의 그룹을 형성하였고 칠면초와 방석 나물이 99%의 BP로 하나의 그룹을 형성하였으며 나문재와 해홍나물이 BP 99%로 하나의 그룹을 형성하였다(Figure 1C). psbA-trnH 영역의 tree length는 100이고 일관성지수 와 보존지수는 각각 0.980, 0.966으로 나타났다. trnL-trnF 영역의 경우 BP는 66~99%로 나타났다. 나문재가 하나의 독립적 그룹을 형성하였으며 칠면초와 방석나물이 하나의 그룹으로 기수초와 해홍나물이 각각 그룹을 형성하고 나문 재에 비해 비교적 유전적으로 가까운 거리를 나타내었다 (Figure 1D). trnL-trnF 영역의 tree length는 94였으며 MP tree의 일관성지수는 0.989, 보존지수는 0.987이었다. DNA 바코드 4개 영역의 종간 유연관계를 확인한 결과 ITS 영역 에서는 칠면초와 해홍나물이 하나의 그룹을 형성하고 psbA-trnH과 trnL-trnF 영역에서 칠면초와 방석나물이 하 나의 그룹을 형성하는 것을 볼 수 있었으며, psbA-trnH 영 역에서 나문재와 해홍나물이 하나의 그룹을 형성하는 것으 로 나타났기 때문에 종간 구분이 명확하지 않았다. 그러나 DNA 바코드 4개의 영역을 조합하여 분석한 결과 5개의 그룹을 형성하는 것을 확인 하였다(Figure 2). BP는 84~100%로 나타났으며, 칠면초와 방석나물이 유전적 유연 관계가 가장 가까웠고 나문재가 가장 유전적 유사성이 낮게 나타났다. 4개 영역 조합을 통한 계통수의 tree length는 523 이고 MP tree의 일관성지수 0.915, 보존지수는 0.952로 나 타났다(Table 3).

고 찰

나문재속 식물은 아시아, 아프리카, 아메리카, 유럽, 오세 아니아에 이르기까지 전 대륙에 걸쳐 세계적으로 서식하고 있는 것으로 알려져 있으며 형태적 유사성과 특이한 서식지 역으로 인해 나타나는 많은 생태형 때문에 종간 구분이 매 우 어렵다(Fisher et al., 1997). 한반도에는 5종의 나문재속 이 분포하는 것으로 알려져 있으며 이 중 나문재는 형태적 으로 매우 뚜렷한 특징을 보이고 있어 구분이 쉬우나 칠면 초와 해홍나물은 형태적 유사성으로 인해 구분이 매우 어렵 다. 방석나물(Chung, 1992)과 기수초(Shim et al., 2001)는 비교적 최근에 국내 미기록종으로 보고되었다.

본 연구 결과에서 제시하고 있는 4개 영역의 DNA 바코 드 염기서열을 조합한 종간 유연관계 분석은 한국산 나문재 속의 분류군이 5계통이라는 것을 지지하고 있다(Figure 2). 이러한 결과는 RAPD 분석을 통한 나문재속의 종 구분 결 과와 일치하고(Shim and Choi, 2004), ITS 영역과 psbB-psbH 영역의 염기서열을 근거로 방석나물과 해홍나 물을 하나의 그룹으로 제시한 Lee et al(2007)의 연구결과 와는 다르게 나타났다. 각각의 바코드 영역에서 확인한 결 과를 보면 ITS 영역의 경우 칠면초와 해홍나물 그리고 방석 나물과 해홍나물의 구분이 모호하게 나타나고 있다(Figure 1A). 이는 Shim(2005)의 연구에서 제시한 칠면초와 해홍나 물의 ITS 염기서열이 같은 것과 일치하였다. 이 결과는 아 메리카에 서식하고 있는 나문재속 13종 중 7종이 동일한 ITS 염기서열을 갖는 것으로 알려져 있는 것과 유사하다 (Brandt et al., 2015). 그리고 엽록체 DNA인 matK 영역은 나문재속 식물 간 구분이 psbA-trnH과 trnL-trnF 영역에 비해 잘 이루어지는데 psbA-trnH과 trnL-trnF 영역에서는 칠면초와 방석나물이 구분되지 않는 것을 알 수 있다 (Figure 1C, D). 한편 psbA-trnH 영역에서는 나문재와 해홍 나물이 구분되지 않았다(Figure 1C). 이는 향나무절 식물의 계통수 분석에서 나타난 결과와 같다(Hong et al., 2014). 본 연구에서 각 종에 대한 서식지역별 염기서열의 차이는 4개의 DNA 바코드 영역에서 나타나지 않았다. 이는 동일 종 내에서 엽록체 DNA 염기서열이 차이를 보이지 않는 것으로 제시한 Kim et al(2008)의 연구와 같은 결과를 보이 고 있다. 다만 해홍나물의 경우 전북 부안(JP)과 전남 무안 (HH)에서 채집하였는데 부안에서 채집한 해홍나물은 하나 의 분류군을 형성한 반면 무안에서 채집한 해홍나물(HH H107)의 경우 방석나물과 같은 염기서열을 형성하여 방석 나물 생태형을 해홍나물로 잘못 구분한 것으로 판단된다 (Figure 2). 해홍나물(JP H091, H092, H199)은 trnL-trnF 영역에서 S. salsa(MF073741.1)와 염기서열이 동일하게 나 타났으며(Figure 1D) psbA-trnH 영역에서는 S. glauca (JN047268.1)와 염기서열이 같았다(Figure 1C). 따라서 본 연구의 결과, 해홍나물로 분류한 나문재속 식물의 명확한 명명을 제시하기 위해서는 향후 보다 정밀한 형태학적 자료 와 더불어 생태학적 자료가 필요할 것으로 보인다.

본 연구의 계통수분석에 사용한 4개 영역의 DNA 바코드 의 염기서열 분석결과는 각각 다른 계통수를 형성하여 차이 를 보이고 있었지만, 핵과 엽록체 DNA 염기서열 조합을 통해 유용한 계통분류의 결과를 얻을 수 있었다. 그러나 한 국산 나문재속 식물들에 대해 보다 정확한 진화적 계통관계 를 파악하기 위해서는 향후 형태, 생태, 생리학적 다양한 방법의 세부조사가 필요할 것으로 판단된다.