• 서 론
• 재료 및 방법
• 1. 연구대상 동물
• 2. 미세조직분석법
• 3. 분석방법
• 결과 및 고찰
• 1. 고라니 먹이식물의 미세조직분석법 적용 가능성
• 2. 고라니 배설물의 식물세포 검증

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서 론

소목 사슴과 고라니속 고라니는 중국과 한반도의 고유종으로 중국고라니(Hydropotes inermis inermis)와 한국고라니(Hydoropotes inermis argyropus) 2아종이 전 세계에 분포하고 있으며 영국과 프랑스는 동물원에 도입된 중국고라니 일부가 생태계에 유입되어 되어 분포하고 있다(Cooke and Farrell, 1998).

중국에 서식하고 있는 고라니는 서식지의 상실, 음식 및 의약품 재료로 포획과 밀렵의 대상이 된 결과 그 서식범위와 개체수가 급격하게 감소함에 따라 국제자연보전연맹(IUCN)에서 발표한 멸종위기에 처한 야생동물 목록에 1996년 국제 보호종으로 등록되었으며 중국에서는 이러한 고라니를 복원하기 위해 기초생태 및 식이습성 연구가 활발히 진행되었다(Butzler, 1990; Wang, 1998; Hu et al,. 2005; Harris and Duckworth, 2008). 반면 한국에 서식하고 있는 고라니는 지속적인 농장물 피해를 유발함에 따라 환경부에서 유해야생동물로 지정하여 기초 생태에 대한 연구가 매우 미흡한 상태에서 매년 포획을 통한 밀도조절을 실시하고 있어 멸종을 방지하기 위한 기초연구가 매우 시급하다(Kim et al., 2009).

야생반추동물의 식이습성 대한 연구는 반추동물이 이용하고 있는 서식지 내의 개체군 수용력과 개체군 역동성 등 기초 생태 연구를 위한 중요한 위치를 차지하고 있기 때문에 초식동물의 먹이섭식과 식습관에 관한 과학적 연구는 1970년대 초부터 발생하였으며 이러한 연구의 주된 목적은 야생동물에 의해 이용되어지는 먹이들과 언제, 어떻게 그리고 어디서 먹이를 획득하는지에 대한 정보를 습득 하는데 있다(Korschgen, 1977; Ramirez, 1997).

초식동물의 먹이식물에 대한 연구방법에는 야생에 있는 동물들을 직접 눈으로 관찰하는 직접관찰법(direct observation), 동물사육(hand-reared animals), 먹이섭식 장소 조사(feeding site surveys), 배설물(feces)과 위(gastrointestinal)내용물 분석방법을 통해 실행되고 있다(Litvaitis, 2000; Guo and Zhang, 2005).

우리나라와 같은 지형에서 고라니, 노루와 같은 반추동물들을 직접관찰 하기는 매우 어렵기 때문에 대상동물의 족적, 배설물, 섭식흔적 등의 흔적조사를 통한 간접적인 관찰에 의해 식이습성에 대한 조사가 이루어 졌으며 최근에는 위 내용물의 유전자 분석을 이용한 먹이식물에 대한 연구가 이루어지고 있다(Lee, 2003; Park et al., 2010)

그러나 이러한 방법에 따른 초식동물의 식이습성에 대한 연구는 많은 시간과 비용 및 노력이 필요하기 때문에 최근에는 야생반추동물의 먹이식물을 정확하고 간편하게 분석하기 위한 방법으로 초식동물의 배설물에 포함된 식물조각의 종(Species)단위 분석이 가능한 미세조직분석이 이용되고 있으나 우리나라에서는 미세조직분석법에 대한 연구가 매우 미흡하다(Giannoni et al,. 2005; Sierra et al., 2005; Wegge et al., 2006; Ferreira and Alves, 2009; Lieverloo et al., 2009; Katona et al., 2010).

따라서 본 연구는 한국에 서식하고 있는 고라니의 체계적인 관리 및 지속적인 보전방안 마련을 위한 기초연구로서 고라니의 먹이식물을 분석하는데 있어 미세조직분석법 적용의 가능성을 조사하기 위해 산림생태계에서 섭식 가능한 대표 식물과 인가에서 섭식 가능한 농작물을 대상으로 식물세포특징에 대해 비교 분석하였다.

재료 및 방법

1. 연구대상 동물

미세조직분석법에 필요한 배설물을 얻기 위해 강원도 홍천에 위치한 농가의 사육시설에서 암컷 고라니(Hydropotes inermis) 1개체를 2006년 9월 18일부터 10월 22일까지 35일간 사육하였다. 고라니가 광엽성식물을 주로 섭식한다는 기존 연구 결과에 따라 농작물인 고구마(Ipomoea batatas), 콩(Glycine max)과 우리나라 전역의 산림 내에서 쉽게 섭식이 가능한 산딸기(Rubus coreanus), 칡(Pueraria thunbergiana)을 본 연구의 고라니 먹이식물로서 선택하였다. 각 식물을 7일 주기로 섭식하게 한 후 각각의 배설물을 수집하여 분석하였다(Lee, 2003; Guo and Zhang, 2005).

2. 미세조직분석법

배설물에 소화되지 않고 남아 있는 식물조각을 수집하기 위하여 각각의 배설물을 증류수 100ml가 담긴 용기에 4~5조각씩 넣고 마그네틱스틸러와 함께 핫플레이트에서 20분간 작동하여 분쇄하였으며 분쇄된 배설물은 배설물 찌꺼기가 없어질 때까지 계속해서 세척하였다.

식물조각의 세포표면에 붙어있는 유기물질과 염록소를 제거하기 위하여 Jerry et al.(1982)의 방법에 의해 가정용 세척제(Ⓡ유한락스) 50ml와 함께 플라스틱 용기에 넣어 30분간 유지하였으며 완전히 세척된 식물조각을 가정용 세제가 모두 제거될 때 까지 증류수를 이용하여 2~3회에 걸쳐 깨끗하게 씻어주고 모든 과정이 끝난 완성된 식물조각을 증류수와 함께 페트리디쉬에 넣어 냉장보관 하였다.

3. 분석방법

먹이식물의 모용, 표피세포, 기공, 장세포, 결정체를 확인하기 위하여 Nicon Eclipse 600 현미경을 사용하였으며 ×100, ×400 배율로 관찰하였고 발견된 각 세포는 디지털 카메라인 soundvision cmos pro s1010으로 총 148개의 세포 사진을 촬영하였으며 식물세포분석은 Johnson et al.(1983)과 Carriere(2002)의 분석법을 적용하였다.

모용의 형태는 크게 선단으로 갈수록 좁아지는 설상(Ligulate), 선단이 뭉툭한 유두상(Papillate)과 다세포로 형성된 복합상(Compund)으로 구분하였다.

기공은 모용의 형태가 유사하여 동정이 불가능한 경우 기공복합체의 형태와 세포벽의 모양에 따라 2차적인 종동정 분석이 가능한 세포로 기공은 4개 이상의 세포가 기공복합체를 구성하고 있는 불규칙형(Irregular), 3개의 세포가 기공복합체를 구성하고 있는 불균등형(Three unequal), 2개의 세포가 기공의 공변세포(guard cell)와 평행하게 기공복합체를 구성하고 있는 평행형(Parallel)으로 구분하였다.

표피세포는 세포의 모양과 세포벽의 형태에 따라 각 또는 원형으로 이루어진 다각형 세포(Angular cells)와 규칙 또는 불규칙한 형태의 굴곡형 세포벽으로 형성된 퍼즐형 세포(Contour cells)로 구분하였으며 표피세포의 모양은 과, 속, 종 및 같은 식물을 부위 사이에도 다양하고 어떤 식물종은 여러개의 표피층을 가지고 있기 때문에 본 연구에서는 표피세포의 의미를 식물종의 잎에 있는 세포를 포함한 잎의 표피에 한정하였다.

장세포는 잎맥과 줄기를 구성하고 있는 세포의 형태에 따라 직사각형(Rectangular), 방추형(Spindle-shaped), 펴즐형(Puzzle), 다각형(Angular)으로 구분하였으며 장세포에 포함되어 있는 결정체는 별모양, 정사각형, 직사각형으로 세포의 형태에 따라 구분하였다.

고라니의 배설물에서 발견된 먹이식물의 식물세포를 검증하기 위해 4가지 식물의 식물세포와 배설물 내의 식물세포와 일치하는지에 대한 비교 분석을 실시하였다.

결과 및 고찰

1. 고라니 먹이식물의 미세조직분석법 적용 가능성

한국에 서식하고 있는 고라니의 먹이주기 실험을 통해 얻은 배설물에서는 식물세포의 모용, 표피세포, 기공, 장세포와 결정체가 확인되었으며 이러한 식물세포의 형태 및 모양의 특징의 종합적인 분석을 통해 4가지 식물의 종동정이 가능하였다.

배설물에서 발견된 각 식물의 모용을 비교 분석한 결과 고구마, 산딸기, 칡의 모용은 기저세포가 타원형으로 선단으로 갈수록 좁아지는 설상(Ligulate)이고 콩의 모용은 선단이 뭉툭한 유두상(Papillate)이였다(Figure 1).

Fig. 1.Analysis of trichomes in faecal preparation (Plant species 1: Ipomoea batatas, 2: Rubus coreanus, 3: Glycine max, 4: Pueraria thunbergiana)

모용은 표피세포, 기공, 결정체보다 식물 종 사이에서 가장 뚜렷한 특징을 보이는 세포로 모용의 형태에 따른 식물 종 구분이 가능하여 먹이식물을 동정하는데 있어 가장 중요한 정보를 제공하기 때문에 모용을 이용한 초식동물의 먹이식물 분석과 형태적으로 매우 유사한 속 단위의 식물 분류를 위한 식물해부학에서 활발히 진행되고 있는 식물 세포로서 본 연구에서도 각 식물세포 중 모용의 형태와 모양이 식물종을 동정하는데 있어 매우 중요한 것으로 확인되었다(Rollins, 1948; Heintzelman and Howard, 1948; Carriere, 2000; Marrero and Nogales, 2005).

표피세포는 고구마의 경우 형태를 확인할 수 없었고 산딸기는 선형으로 된 세포벽이 원형과 각으로 이루어진 다각형 세포(Angular cell)였으며 콩과 칡의 표피세포는 불규칙한 형태의 굴곡형 세포벽으로 이루어진 퍼즐형 세포(Contour cell)였다(Figure 2).

초식동물의 소화과정은 큐티클이 표피세포들을 둘러싸고 있을 경우에 다년생식물의 표피에 약간의 영향을 주며 미성숙 식물들과 일년생 식물 및 광영성 초본의 표피세포는 저작과 소화에 의해 부식될 수 있다(Gill et al., 1983). 그럼에도 불구하고 표피세포의 모양은 동일한 식물의 과, 속, 종과 부위에 따라 매우 다양하고 강한 빛과 대기의 습도 등과 같은 환경요인에도 영향을 받으며 장소와 년도에 따라 크기, 모양 및 세포벽이 다양하기 때문에 식물 조각을 동정하는 데 많이 사용되어지고 있다(Metcalfe and Chalk, 1950; Johnson et al., 1983). 이번 연구에서도 배설물에서 발견된 고구마의 표피세포는 부식에 의해 형태 확인이 불가능 하였으며 콩과인 콩과 칡의 세포 형태는 매우 유사하게 나타났으나 산딸기는 전혀 다른 형태의 세포형태를 지니고 있었다.

기공은 고구마의 경우 기공복합체의 형태와 세포벽의 모양이 부식되어 형체확인이 불가능 하였고 산딸기는 4개 이상의 세포가 기공복합체를 구성하고 있는 불규칙형(Irregular)이였으며 콩과 칡의 기공은 2개의 세포가 기공의 공변세포와 평행하게 기공복합체를 구성하고 있는 평행형(Parallel)이였다(Figure 3).

Fig. 3.Analysis of stomata of faecal preparation (Plant species 1: Ipomoea batatas, 2: Rubus coreanus, 3: Glycine max, 4: Pueraria thunbergiana)

기공은 기공의 배열에 따라 광엽성식물과 외떡잎식물인 사초과와 벼과의 식물의 동정이 가능한 것으로 보고되고 있어 초식동물의 먹이식물 분석에 많이 사용되어 지고 있으나 일반적으로 기공복합체의 특징만으로 식물종 동정이 불가능한 세포이므로 다른 세포특징들과 종합적인 분석에 이용되는 세포이다(Johnson et al., 1983; Metcalfe, 1960; Carriere, 2000; Marrero, 2004; Guo and Zhang, 2005). 이번 연구에서는 광엽성식물을 연구에 이용했기 때문에 외떡잎식물의 기공배열과의 차이를 확인할 수 없었으나 광엽성식물 내에서도 각 식물이 구성하고 있는 기공의 특징이 서로 다르게 나타났다.

장세포는 식물의 잎맥과 줄기의 2가지 부위를 분석한 결과 고구마의 장세포 모양은 잎맥에서 방추형 , 줄기에서 방추형과 직사각형 모양의 세포들로 구성되어 있었으며 산딸기의 장세포는 잎맥과 줄기 모두 직사각형 모양의 세포들로 구성되어 있었고 콩의 장세포는 잎맥에 직사각형 세포에 사각형의 결정체가 존재하였으며, 줄기는 방추형의 세포로 구성되어 있었고 칡의 장세포는 잎맥이 방추형, 줄기는 직사각형의 세포에 사각형의 결정체가 존재하고 있었다.

장세포는 기공의 배열과 마찬가지로 외떡잎식물 중 사초과와 벼과 등 잎이 좁은 초본에서 선형의 세포벽 형태로 이루어진 좁은 관 모양의 세포가 평행하게 나열되는 특징을 지니고 있어 광엽성식물들과 외떡잎식물의 1차적인 구분이 가능한 세포로 이번 연구에서는 광엽성식물을 연구에 사용하였기 때문에 장세포의 형태적인 특징만으로 종동정은 불가능 하였으나 식물종에서 확인된 모용, 표피세포, 기공의 세포 형태의 특징과 함께 종합적인 분석할 경우 식물종을 동정이 가능하였다(Johnson et al., 1983).

Fig. 4.Analysis of long-cell and crystals in long- cells(vein - 1, 3, 5, 7 and stem - 2, 4, 6, 8) of faecal preparation (Plant species 1, 2: Ipomoea batatas, 3, 4: Rubus coreanus, 5, 6: Glycine max, 7, 8: Pueraria thunbergiana)

2. 고라니 배설물의 식물세포 검증

고라니의 배설물에서 획득한 4가지 식물의 식물세포를 검증하기 위해 먹이식물로 사용된 4가지 식물의 세포를 비교 분석한 결과 고구마는 모용, 장세포가 일치하였고 배설물에서 부식으로 인해 확인이 불가능 하였던 표피세포는 일정한 형태의 굴곡형 세포벽으로 이루어진 퍼즐형 세포인 것으로 확인되었으며 기공은 4개 이상의 세포가 기공복합체를 구성하고 있는 불규칙형이고 산딸기의 식물세포는 배설물과 식물에서 모용, 기공, 표피세포, 장세포 모두 일치하였다(Figure 5).

콩과 칡의 식물세포는 고라니의 배설물과 먹이식물에서 모용, 기공, 표피세포, 장세포 모두 일치하였으며 같은 콩과 식물로서 미세조직분석에 사용되어지는 세포의 형태가 매우 유사하였으나 모용과 장세포의 형태, 결정체의 유무와 형태에 따라서 두 종의 구분이 가능하였다(Figure 6).

Fig. 6.Comparison analysis of faecal preparation(1-trichomes, 3-stomata, 5-epidermal cell, 7-long cell of vein, 9-long cell and crystals of stem) and reference preparation(2-trichomes, 4-stomata, 6-epideral cell, 8-long cell of vein, 10-long cell and crystals of stem) of Glycine max and Pueraria thunbergiana

한국에 서식하는 고라니의 먹이식물 분석을 위한 미세조직분석법의 적용가능성과 초식동물의 먹이식물에 대한 연구의 기초자료를 마련하기 위해 실행된 이번 연구는 먹이주기 실험으로 얻은 배설물과 먹이식물의 세포를 분석한 결과 모용의 형태가 섭식식물의 종 동정에 가장 중요한 것으로 확인되었으며 식물세포인 표피세포와 기공의 형태 및 배열, 장세포의 형태 및 결정체의 유무와 같이 각 세포가 지니고 있는 특징에 따라 섭식식물의 2차 동정이 가능하였다.

그러나 본 연구는 가을철인 9월에서 10월의 짧은 기간 동안 광엽성식물 초본으로 이루어진 4개의 식물만을 이용한 먹이주기 실험을 통해 분석된 자료로서의 한국에 서식하는 고라니 먹이식물을 전체를 대상으로 미세조직분석법을 적용하기에는 한계가 있다. 그러나 기존 연구 결과에 따르면 중국에 서식하고 있는 고라니가 선호하는 먹이식물은 광엽성식물로서 집중형 섭식동물(concentrate feeder) 또는 광엽성 섭식동물(browser)인 것으로 조사되었으며 국내에 서식하는 고라니 역시 광엽성식물을 주로 섭식하는 것으로 확인되었다. 따라서 이번 연구 결과인 한국에 서식하는 고라니의 배설물을 이용한 미세조직분석법은 초식동물인 국내 우제목의 먹이식물을 연구하는데 충분이 적용이 가능한 것으로 판단된다(Lee, 2003; Guo and Zhang, 2005; Kim et al., 2010).

미세조직분석법(Microhistological analysis)을 초식동물의 먹이식물 분석에 적용하기 위해서는 우선적으로 다양한 현지조사를 통해 서식지내에 분포하고 있는 먹이식물에 대한 충분한 선행연구가 필요하다. 또한 식물체의 분석과정과 식물의 특성을 판별하는 숙련된 분석기술을 갖추어야 할 뿐만 아니라 배설물 분석과 대조할 수 있는 실제 먹이 식물조직에 대한 대조표본(reference materials)이 필요하다(Holechek et al., 1982). 따라서 지속적으로 고라니 개체의 배설물과 식물을 수집하여 먹이 식물에 대한 세포 도감을 작성한다면 산림 내 서식하고 있는 고라니의 서식지내 적정 밀도 및 수용력 등 고라니의 기초생태 연구 및 기후변화에 의해 이동되는 식물군락의 위치가 고라니의 서식지 내의 먹이식물 이용과 행동권 변화에 미치는 영향 등의 기후변화적응을 위한 고라니의 행동생태의 변화상 등 다양한 연구를 진행하기 위한 기초자료로서 이용 가능할 것으로 사료된다.