서 론
야생조류는 지구환경의 지표(Koike and Higuchi, 2002; Sergio, 2003; Both et al., 2006; Judit K et al., 2012; BirdLife International, 2013), 환경오염의 지표(Burger, 1993; Movalli, 2000), 서식환경의 지표(Ueta et al., 2006; Sakai et al., 2011)로서 중요한 역할을 한다. 특히 맹금류는 생태계의 최상위 포식자로서 먹이생물 의 개체수를 조절하고 생태계의 안정화를 위해 중요한 분류 군으로 알려져 있다(Lee, 2004). 그래서 지역의 맹금류 서 식정보는 지역의 다양한 참조 자료(reference data)와 함께 생태계의 건강성을 평가하는데 중요한 자료가 되고 있다. 현재 국내 맹금류의 서식정보는 환경부와 문화재청의 조사 와 연구로 파악하고 있지만, 11개의 환경부 지정 광역 야생 동물구조센터와 240여개의 천연기념물 동물치료소에서도 지역의 맹금류를 포함한 야생조류 정보가 대량으로 수집되 고 있다(NIBRa, 2011).
한편, 최근들어 맹금류 서식환경은 산업화와 도시화로 인 한 서식지 단절, 먹이생물의 감소, 로드킬(road-kill)과 조류 충돌(bird-strike) 등으로 많은 위협에 노출되고 있다. 특히 로드킬과 조류충돌과 같이 차량 및 인위적인 구조물에 충돌 하여 부상당하거나 사망하는 사례는 지속적으로 발생하고 있다(NIBRb, 2011). 현재 국내의 광역야생동물구조센터에 서 수집하고 있는 야생동물의 유전자 시료는 연간 5,000여 건이고, 최근 3년간(2009~2011년) 구조한 맹금류는 약 800 여 개체에 이른다(NIBRa, 2011; NIBRb, 2011). 경기도 파 주시의 한국조류보호협회 천연기념물구조센터에서도 매년 수십 개체의 맹금류가 구조되거나 폐사체로 들어오고 있다. 이러한 로드킬 및 조류충돌, 또는 부패가 심한 봄철부터 여 름철에 수집되는 맹금류 폐사체는 형태적 방법으로 종을 판별하기 어렵기 때문에, 지역단위의 중요한 맹금류 서식 정보를 획득하거나 보호방안을 수립하는데 한계가 있다.
최근, 폐사한 야생동물에서 DNA를 추출하여 특정마커 로 생물을 분류하는 기법인 DNA 바코드 연구기법이 등장 하였다(Hebert et al., 2004). DNA 바코드는 유전체내 종분 류에 유용한 특정 유전자의 염기서열을 거대 데이터베이스 에 참조표본(reference standard)으로 등록하여 염기서열의 상동성 비교를 통해 종을 동정하는 기법이다(Hebert et al., 2003). DNA 바코드에 많이 이용되는 mtDNA는 원형이며, 모계유전을 하고 재조합(recombination)이 일어나지 않으 며, 변이가 많은 특징이 있다(Jin et al., 2012). 특히 조류의 DNA 마커로써 COI 유전자는 분류군을 동정하는 데 유용 한 마커로 알려져 있으며, 종간 변이가 심하고 종내 변이가 매우 적어 최근 유전자 변이를 이용해 종의 분류마커로 이 용하려는 시도가 계속되고 있다(Hebert et al., 2003; Jin, 2012). 또한 목(Order), 과(Family), 속(Genus) 단계의 형태 학적 분류체계와 비교해도 대부분 일치할 정도로 종 동정의 유용성이 입증되고 있다(Hebert et al., 2004; Jin et al., 2012).
본 연구는 2011년 6월 28일에 파주시 조리읍 장곡리 일 대에서 부패한 상태로 수집되어 정확한 종 분류가 어려운 맹금류 폐사체에 대해 mtDNA COI 유전자의 서열을 이용 한 종 동정과 CHDW-CHDZ 유전자의 성별 이형성을 이용 한 분자 성판별을 통해 지역의 맹금류 서식정보를 정확히 기록하는데 있다.
연구방법
1.연구재료 및 DNA 추출
한국조류보호협회 파주지회에서 제공 받은 폐사체 맹금 류 1개체의 DNA를 추출하기 위해 형태적 동정에 방해되지 않게 윗꼬리덮깃(uppertail-covert) 3개와 발바닥 조직을 채 취하였다. 깃털의 깃촉(calamus)부분은 얇게 자르고 발바닥 조직은 분쇄기(homogenizer)를 이용하여 DNA를 추출하였 다. DNA는 PrimePrepTM Genomic DNA Isolation Kit (Genetbio, Korea)을 이용하여 지침서에 따라 추출하였고, 실험에 이용될 때까지 4℃에 저장하였다. 계통분석은 BOLD systems과 NCBI Genbank에서 기 보고된 왕새매(Butastur indicus) 5개체, 말똥가리(Buteo buteo) 1개체, 털발말똥가 리(B. lagopus) 1개체, 큰말똥가리(B. hemilasius) 1개체, 솔 개(Milvus migrans) 1개체, 벌매(Pernis ptilorhynchus) 1개체, 흰꼬리수리(Haliaeetus albicilla) 1개체, 황새(Ciconia boyciana) 1개체의 COI 유전자를 확보한 후 분석하였다(Table 1).
2.COI 유전자의 polymerase chain reaction(PCR) 증 폭과 DNA 시퀀싱
Genomic DNA를 PCR 반응의 주형(template)으로 이용 하여 mitochondrial DNA(mtDNA)의 COI 유전자를 증폭하 였다. COI 유전자 증폭을 위한 PCR 조성은 주형 1ul, primer BirdF1(5'-TTCTCCAACCACAAAGACATTGGCAC-3') 와 BirdR1(5'-ACGTGGGAGATAATTCCAAATCCTG-3') (Hebert et al., 2004) 각 5pmol, Prime Taq Premix(2X) (Genetbio, Korea) 10ul에 전체 볼륨 20ul되도록 D.W를 첨 가하였다. PCR 조건은 초기 변성(predenature)으로 95°C에서 5분간 반응시킨 후, 95°C에서 30초, 54°C에서 30초, 72°C에서 30초에서 35회 반복하였으며, 72°C에서 7분간 최종신장(final extension)후 4°C에서 종료하였다. 또한, 성판별을 위한 PCR은 primer P8 (5'-CTCCCGAGAATGAGRAAYTG-3'), P2 (5'-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3'), NP (5'-GAGAAACTGTGCAAAACAG-3'), MP (5'-AGTCACTATCAGATCCGGAA-3')
를 사용하였고(Ito et al., 2003), PCR 조건은 초기 변성 과정으로 95°C에서 5분간 반응시킨 후, 94°C에서 45초, 55°C에서 45초, 72°C에서 1분에서 35회 반복하였으며, 72°C에서 7 분간 최종 신장 후 4°C에서 종료하였다. PCR 증폭산물은 PCR Purification kit(Bioneer, Korea)을 사용하여 정제하였으 며 염기서열 분석은 Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(v3.0, Applied Biosystems, CA, USA)을 사 용하였다.
3.데이터 분석
결정된 COI 염기서열의 유사도 검색을 통한 종 동정과 근연종과의 계통 유연관계 분석을 수행하였다. 먼저 결정된 서열을 이용한 종 동정을 위하여 DNA database에 기 보고 된 서열과의 상동성을 검출하기 위해 NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 검색과 BOLD systems (http://www.boldsystems.org/views/login.php)을 이용한 검 색을 수행하였다. 검색결과에서 확인된 최고서열을 보유한 종을 후보종으로 선정하였다. 근연종 서열은 최고유사서열 이후 검출된 근연종 7종의 COI 서열을 선정하였다. ClustalW program(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)과 Bioedit program 을 이용하여 수집한 모든 서열들을 다중정렬하였다. 서열 간 변이율의 산출을 위해 Kimura 2 parameter (K2P) 모델 을 이용하여 pairwise distance를 산출하였고, 계통유연관계 분석을 위한 계통수 작성은 MEGA6 program을 이용하여 Neighbor-Joining(NJ) tree(Tamura et al., 2013)를 작성하 였다.
결과 및 고찰
본 연구에서 사용된 폐사체 맹금류는 한국조류보호협회 파주지회가 2011년 6월 28일 파주시 조리읍 장곡리 인근 도로에서 발견한 것이다. 당시 폐사체는 형체를 알아볼 수 없을 만큼 두부쪽이 손상되었고, 크기는 말똥가리보다 작고 새매와 유사하였다. 그리고 턱 밑의 희미한 세로줄과 얇고 긴 날개, 꼬리깃과 첫째날개깃에 깃집(feather sheath)이 전 체적으로 남아있었다(Figure 1 ). 일반적으로 맹금류는 부화 후에 솜털(natal down) 상태에서 유조깃(juvenile plumage) 으로 완전 깃갈이(complete moult)를 하기 때문에 깃집 (feather sheath)이 대부분 남아있고, 익년 여름깃(1st summer plumage)으로 깃갈이를 할 때에는 부분 깃갈이(partial moult)를 하므로 2~3개의 깃집이 관찰된다(Satoshi et al., 2004; Frank, 2006; David et al., 2007). 이러한 제한된 외형 적인 정보를 바탕으로 추정해보면 당해연도에 태어난 왕새 매 유조로 추정하였다. 그러나 정확한 종 동정이 어렵고 암 수 유무도 판단할 수 없어 DNA 바코드 기법을 이용한 종동 정과 DNA를 이용한 암수구분을 실시하였다.
DNA 바코드 기법을 이용한 분류를 위해 폐사체 맹금류의 윗꼬리덮깃과 발바닥에서 조직을 때어내어 DNA를 추출하 여 총 2개의 DNA를 확보하였고, mtDNA COI 유전자를 PCR 증폭한 후 염기서열 분석하여 695bp의 염기서열을 획 득하였고 Genbank(Accession No. KM874454)에 등록하였 다(Table 1., Appendix. 1).
이렇게 획득한 염기서열을 BOLD systems과 NCBI BLAST에서 유사도 검색을 수행한 결과 총 5개체의 왕새매 (Butastur indicus) COI 서열이 검색되었는데, 본 연구의 폐사체에서 결정된 COI 서열과 100% 일치하는 결과를 보 였다(Figure 2). 왕새매는 중국동북부와 북한에서 번식하 는 집단과 일본에서 번식하는 집단으로 크게 나뉘는 데 (Kim, 2010), 이와 같이 100% 일치하는 결과로 우리나라에 서 번식하는 집단이 일본 번식집단과 관계가 있을 가능성을 나타낸다. 하지만 COI 유전자의 경우 종 단위 분류에 주로 사용하기 때문에 왕새매와 같이 단일종의 집단 간 차이를 밝히는 데는 한계가 있다(Jin, 2012). 향후 개체 간 변이가 큰 D-loop 부위나 초위성체(microsatellite) 분석을 중국동 북부 및 북한 집단과 함께 비교분석하여 집단 간의 차이를 규명하는 연구가 필요하다.
왕새매는 매목 수리과에 속하는 단일종으로 암색형의 변 이가 있으며, 분포지역은 중국 동북부, 북한, 일본에서 번식 하고, 중국 남부와 동남아시아에서 월동한다. 국내에는 봄, 가을 많은 개체수가 통과하는 나그네새로 매우 드물게 번식 하는 것으로 알려져 있다(Park and Seo, 2008; Kim, 2010). 수리과의 다른 맹금류들과 계통도 분석을 위해 외군 (outgroup)을 황새로 하여 분석한 결과 크게 3개의 계통군 (clade)으로 나눠졌고, 말똥가리, 큰말똥가리, 털발말똥가 리, 흰꼬리수리가 첫 번째 계통군를 형성하였고, 본 연구의 왕새매와 솔개가 두 번째 계통군을 형성하였다. 벌매의 경 우 다른 2개의 계통군과 크게 분리되는 현상을 보였다. 따라 서 국내 서식종 중 왕새매는 솔개와 근연종으로 나타났고, 이는 Heather(2007)의 결과와 유사하였다(Figure 2).
본 연구에서 이용된 왕새매는 전장 362㎜, 익장 282㎜, 부리길이 19.7㎜, 부척길이 63.2㎜, 미장 155.5㎜로 Kang et al.(2012)의 연구에서 기록된 4주령 왕새매 어린새보다 전체적으로 크고, Azma(2007)의 왕새매 성조의 크기보다 다 소 작은 것으로 보아 이소직전의 개체로 판단된다(Table 2).
본 연구의 왕새매 DNA를 이용한 암수구분을 위해 P8, P2, NP, MP의 4개 primer를 이용하여 PCR 증폭한 후 전기 영동한 결과 2개의 PCR 밴드가 관찰된다는 점에서 해당 개체의 DNA는 암컷에서 유래된 것으로 추정되었다(Figure 3). 대부분의 조류는 포유류와 달리 성염색체가 수컷이 ZZ 의 동형접합이고 암컷이 ZW인 이형접합으로 알려져 있어, 성염색체 상에 위치하는 CHDZ-W 유전자의 PCR 산물에서 밴드가 1개이면 동형접합인 수컷이고, 2개이면 이형접합인 암컷으로 판단한다(Ito et al., 2003; Lee et al., 2008; Milos et al., 2013).
왕새매의 과거 번식기록을 보면 외국학자에 의해 1948년 경기도 안양 일대에서 번식둥지 3개소와 1968년 본 개체와 유사지역인 파주시 비무장지대(DMZ) 일대에서 번식둥지 1개소 등 단 2회의 기록이 있다. 이후 2011년 경기도 포천시 내촌면 일원과 2012년 6월 14일 충북 충주시 엄정면 일대에 서 왕새매의 번식둥지 1개소가 확인되었다(Kang et al., 2012).
본 연구 결과로, 파주시에서 폐사체로 발견된 맹금류는 이소 단계의 왕새매 어린 개체로 밝혀졌고, 파주시 일대는 1968년 이후 43년만에 왕새매의 번식 가능성을 확인할 수 있었다. 앞으로 파주시를 비롯하여 인접한 서부 DMZ, 민통 선 일대의 왕새매 서식환경과 서식정보를 지속적으로 수집 할 수 있는 조사․연구가 이뤄져야 할 것이다. 특히 광역 야생 동물구조센터보다도 기초자치단체의 야생조류 구조단체는 지역 생물종에 대한 1차 정보를 수집하는 중요한 거점 역할 이 가능하기 때문에 지역의 관련 대학 및 연구소 또는 중앙 부처 및 기관과 긴밀한 생물다양성정보 네트워크가 이뤄진 다면, 자체 소각되어 귀중한 희귀 생물을 상실할 우려를 줄 일 수 있을 것이다. 마지막으로 폐사체에서 추출된 왕새매 의 DNA 시료와 DNA 바코드인 COI 유전자는 향후 유사종 의 연구에 참조표본(reference standard)로 이용될 수 있어 국립중앙과학관을 비롯한 국내 야생동물유전자은행 등에 서 다양한 연구에 사용될 수 있는 계기가 될 것이다. 이러한 연구 네트워크는 궁극적으로 왕새매의 분자유전학, 계통지 리학 연구 등에 이용되어 맹금류 보전에 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 판단된다.
