서 론

배스(Micropterus salmoides)는 농어목(Perciformes), 검 정우럭과(Centrarchidae), 검정우럭속(Micropterus)에 속하 는 어류로서 원산지는 미국 남동부(플로리다, 미시시피강 유역)와 미네소타, 위스콘신, 다코타 등 오대호 유역으로 매우 광범위하게 분포하고 있다(Kim, 1997;Nelson, 2006). 우리나라는 1970년대에 수산청에서 미국의 양어장으로부 터 3~4cm 치어 500마리를 어족 자원조성을 통한 단백질 공급을 목적으로 도입하였고, 양어에 성공하여 팔당호를 포 함한 북한강수계의 조종천과 강원도 철원군 민통선 내에 위치한 토교 저수지에 방류하였다(NIER, 1995). 그러나 국 내에서는 식용으로 선호하지 않아 식량자원으로서의 가치 가 하락하여 양식업자들의 양어 포기, 홍수에 의한 양식장 의 범람 등으로 인해 큰 강과 저수지로 방류되어 확산되기 시작하였고, 1990년대 여가 활동이 증가한 이후 일부 낚시 인들에 의한 전국의 저수지 또는 낚시터로의 인위적인 유입 으로 급속하게 확산되어 제주도를 비롯한 우리나라의 전 지역에 널리 분포하고 있다. 배스는 먹이사슬에서 수생태계 의 최상위단계에 위치하며 생태계교란 어종으로서 우리나 라의 토착어류를 비롯한 다양한 수중생물들을 포식하며 이로 인해 담수생태계의 불균형을 초래하고 있다. 우리나라 는 1998년 2월 환경부 자연환경보전법 제2조(정의) 18항에 “생태계위해외래동․식물” 중 생태계교란 어류로 지정하여 배스의 퇴치 및 관리를 위한 다양한 시도를 하고 있지만 많은 인력과 예산 투입에도 불구하고 효율적인 퇴치 방안 모색 및 검증이 미진한 상황으로 담수생태계에 미치는 악영 향은 점차 심각해지고 있는 실정이다(NPRI, 2020;KNPS, 2020).

배스의 생태 ․ 생식적 특성에 대한 연구 내용을 기반으로 한 다양한 퇴치방법에는 낚시, 투망, 정치망, 자망, 족대, 펌핑, 작살, 전기충격, 인공산란장, 천적 등이 있다. 그러나 대부분이 상당한 시간, 경비, 설비 그리고 인력이 필요한 방식이거나 수계 내 다른 어종도 함께 영향을 받는 방식이 기 때문에 실제적인 시행의 결과와 현실적인 효과의 검증은 미흡한 상황이다(ME, 2012). 이 중 인공산란장법은 배스의 생식 습성을 이용하여 산란을 유도한 후 수정란을 제거하는 번식 차단방식으로 수계 내 타 서식 종에 영향을 끼치지 않고 상당수의 개체를 한꺼번에 포획할 수 있는 효과를 가 지고 있다(ME, 2010;NFRDI, 2011). 그러나 인공산란장 이외에 다른 산란장소가 있는 경우에는 포획 효과가 낮다는 단점이 있다(ME, 2012). 이러한 인공산란장법의 장점은 활 용하고 단점은 보완하여 배스의 고유한 생식적 특성에 기반 한 개체군 감소의 효율성을 극대화할 수 있는 방식의 모색 이 요구된다.

동물의 생식세포는 서로 다른 종 간의 수정을 방지하도록 종 특이적인 정자와 난자의 인식 부위를 가지고 있다(Raj et al., 2017). 성게(Arbacia punctulata)의 경우, 정자 머리 표면에 있는 첨체돌기의 빈딘 단백질은 종 특이성을 갖는 단백질로서 난자 난황막의 빈딘 수용체와 결합하고 이후 정자와 난자의 세포막이 융합한 뒤 정자의 핵이 난자의 세 포질로 삽입된다(Foltz and Lennarz, 1992). 어류의 경우, 수컷의 방정 행동으로 물 속에 뿌려진 정자는 편모운동으로 난자로 이동한 후, 각 생식세포 표면에 있는 종 특이적 인식 부위의 결합에 의해 동 종간의 수정이 이루어진다(Hirohashi et al., 2008;Miwa, 2015). Zebrafish의 경우, 정자 표면의 단백질은 난자의 바운서(Bouncer)와 종 특이적 결합을 한 다(Herberg et al., 2018;Lehmann, 2018). 포유동물인 설치 류의 경우, 정자 표면의 Izumo는 난자 표면의 수용체인 Zuno에 의해 인식되어 수정 과정이 완결된다(Avella et al., 2014;Bianchi et al., 2014;Bianchi and Wright, 2015). 그러므로 동종이라 할지라도 종 특이적인 정자와 난자의 결합 부위를 인식하지 못하는 생식세포를 생산하는 개체는 수정 현상을 나타내지 못하므로 불임 개체라고 할 수 있다.

최근 인간에게 특정 질환을 매개하는 해충의 방제에 대한 연구동향을 보면, 방사선 또는 유전자 편집기술로 해충의 불임을 유도함으로써 번식을 차단하는 방법을 개발하여 인류 의 건강에 악영향을 미치는 생물종 퇴치 방법의 유용성을 입증하고 있다(Kyrou et al., 2018;Zheng et al., 2019). 유전자 편집기술(Gene Editing)이란, 질병을 일으키는 DNA를 잘라 없애거나 또는 필요한 DNA를 추가하는 유전자의 수정을 통해 질병을 치료하는 기술이고 특히 유전자의 특정 부분을 정교하게 잘라내는 기술을 유전자가위라고 한다. 현재 유전 자 편집기술 중 가장 각광받고 있는 CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)은 바이러 스의 침입에 저항하기 위한 세균의 면역시스템으로서 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)의 CRISPR Ⅱ 시스템이 가장 많이 알려져 있고 제3세대 유전자 가위로 개발되어 활용되 고 있다(Gantz et al., 2015;Hashimoto and Takemoto, 2015;Elaswad et al., 2018;Trionnaire et al., 2019).

본 연구에서는 배스의 종 특이적 정자-난자 인식 단백질을 암호화하는 유전자를 탐색한 후 CRISPR/Cas9 시스템을 이 용한 유전자 편집을 통해 수정 과정에 필수적인 종 특이적 인식부위가 발현되지 않도록 유도하는 불임 유도 조성물의 개발과정을 확립하였다. 그리고 생태교란어종과 동일한 수 생태계에 속해 있는 고유종 및 토착종의 서식에는 영향을 미치지 않는 효율적인 생태계교란종 관리 방안으로서의 유용 성을 검증하기 위한 연구의 기초 자료를 확보하고자 하였다.

연구방법

전체적인 불임 개체 유도 과정 중 불임유도 조성물의 개 발과정을 중심으로 나열하여 기술하였다. 불임 개체 및 불 임유도 조성물의 개발과정은 Flow chart로 도식화하였다 (Figure 1).

1. 채집 장소

본 연구에 사용된 배스는 2020년 6월, 대구광역시 수성구 욱수동 망월지에서 포획하였다.

2. 배스의 뇌와 생식소(정소, 난소) 적출 및 RNA 추출

실험군은 B1-1(Female, 뇌), B1-2(Female, 난소), B2-1 (Male, 뇌), B2-2(Male, 정소)로 나누고 멸균된 기구를 이용하 여 뇌와 생식소를 신속하게 적출하였다. 적출한 기관들을 1ml의 Trizol reagent에서 분쇄하고, 200㎕의 Chloroform을 첨가한 뒤 15초 동안 섞고 4℃에서 15분간 11,000g으로 원심분리한 후 상층액을 취하였다. 상층액에 500㎕의 isopropanol을 첨가하여 섞은 후 4℃에서 10분간 11,000g으 로 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물을 건조시킨 다 음, 건조된 침전물에 100㎕의 nuclease-free water를 넣어 녹인 후 RNA를 획득하였다. 추출한 RNA의 Quality는 Micro-Spectrophotometer (ALLSHENG, China)를 이용하 여 분석하였다.

3. NGS를 이용한 전사체 분석 및 생식 유전자 탐색

Transcriptome de novo Sequencing을 진행하기 전, 추출된 RNA로 Original sample QC를 수행하여 분석 과정에 사용할 샘플로 B1-2(Female, 난소), B2-1(Male, 뇌) 2종을 선정하였 다. Illumina TruSeq Stranded mRNA LT sample Prep Kit를 이용하여 cDNA library를 구축한 후 Library QC를 수행하고 NovaSeq 6000 system을 활용한 NGS방법으로 paired-end 염기서열을 획득하였다(Macrogen. Inc., Korea). Trimmomatic program을 이용하여 산출된 Raw data에서 adapter 서열, 낮은 quality의 read를 제거한 Trimming data를 획득하였다. Trinity 프로그램을 이용하여 각 샘플로부터 획득한 약 100 million sequencing reads로 de novo assembly를 진행하여 Contig들을 확보한 후 TGICL을 이용하여 assembly와 clustering 을 수행하여 Unigene contig들을 획득하였다. NCBI BLAST 의 BLASTN과 DIAMOND software의 BLASTX (E-value cut-off of 1.0E-5)을 이용하여 획득한 Unigene들을 Annotation 하였고, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), NCBI Nucleotide (NT), Pfam, Gene ontology (GO), NCBI non-redundant Protein (NR), UniProt 그리고 EggNOG의 총 7종의 데이터베이스를 이용하여 관련 유전자 별 기능을 확인하였다. 획득한 데이터 중에서 정자-난자 인식 단백질과 관련한 키워드 ‘Sperm’, ‘Zona Pellucida’, ‘ IZUMO’, ‘Acrosome’을 포함하는 Contig들을 선별하여 CRISPR/Cas9 시스템을 적용할 Target sequence를 탐색하였다(Martyniuk et al., 2013;Vicens et al., 2014;Klangnurak et al., 2018).

4. CRISPR/Cas9 system을 적용할 Target Sequence 선정

프로그램 Geneious Prime (version 11.0.4+11)을 이용하 여 각 Contig를 구성하는 염기서열에서 CRISPR/Cas9 시스 템을 적용했을 때 편집 가능한 서열(Target sequence) 즉, Cas9 nuclease가 인식하는 부위인 PAM (5‘-NGG-3’)을 가 진 20bp의 염기서열을 후보 서열(Target sequence)로 선정 하였다. 배스의 Genomic DNA에서 동일한 서열의 존재 여 부와 Target sequence 내 intron 삽입에 의한 CRISPR/Cas9 system 적용 불가능 여부를 확인하기 위해 각 후보 서열 (Target sequence)을 기준으로 Primers (Table 1, 2)를 디자 인, 제작한 후 PCR을 수행하여 최종 Target sequence를 선 정하였다. 최종 Target sequence를 선정하기 위한 배스의 Genomic DNA 분석 과정은 다음과 같다. 실험군은 B1 (Female), B2 (male)로 나누고 멸균된 기구를 이용하여 지 느러미를 신속하게 적출한 후 DNeasy blood and tissue kit (Qiagen, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. PCR 반응 은 DNA 1㎕(50ng/㎕), 10X buffer 5㎕, 10mM dNTP 1㎕, primer 각각 2㎕(10pmol/㎕), DNA Taq polymerase (solgent, Korea) 0.25㎕, 증류수를 첨가하여 최종 50㎕ 용 량으로 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 initial denaturation한 다음 94℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃ 에서 90초를 1 cycle로 하여 30회 반복한 후, 72℃에서 10 분간 final extension하고 8℃에 보관하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.

5. sgRNA 디자인 및 합성

최종 선정된 Target sequence에 유전자 편집기술을 적용 할 수 있도록 sgRNA을 디자인하고 합성하였다. sgRNA 합성을 위해 Guide-it sgRNA In Vitro Transcription kit (Takarabio, USA)을 이용하였다. sgRNA 합성에 필요한 Template 제작 방법은 다음과 같다. Template 제작용 Forward primers는 Table 3에 나타내었다. Guide-it Scaffold Template 1㎕, Forward primer 0.5㎕(10pmol/㎕), PrimeSTAR Max Premix 12.5㎕, 증류수를 첨가하여 최종 25㎕ 용량으 로 반응하였다. 반응조건은 98℃에서 10초, 68℃에서 10초를 1 cycle로 하여 33회 반복하였고, 반응산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. sgRNA 합성 방법은 다 음과 같다. sgRNA PCR template 5㎕, Guide-it In Vitro Transcription Buffer 7㎕, Guide-it T7 Polymerase Mix 3 ㎕, RNase Free Water 5㎕를 혼합하여 최종 20㎕ 용량으로 37℃에서 4시간 동안 반응하였다. 이어 Recombinant DNase Ⅰ (RNase-Free) 2㎕를 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 반 응하여 sgRNA를 합성하였다. 합성한 sgRNA의 Purify를 위해 Guide-it IVT RNA Clean-Up kit (Takarabio, USA)을 이용하였고 Purify 과정은 다음과 같다. 합성한 sgRNA 22 ㎕, IVT Binding Buffer 30㎕, isopropanol 130㎕, RNase Free Water 78㎕를 혼합한 후 IVT RNA Clean-Up Spin Column을 이용하여 30초간 11,000g으로 원심분리하였다. 이어 Wash Buffer 600㎕로 2회 Washing하고 RNase Free Water 20㎕로 1분간 Incubation한 후 1분간 11,000g으로 원심분리하여 sgRNA를 획득하였다. 획득한 sgRNA는 Micro-Spectrophotometer (ALLSHENG, China)를 이용하 여 정량하였다.

6. sgRNA 효율성 Screening

합성한 sgRNA가 정상적으로 작동하여 Target sequence 를 인식할 수 있는지에 대해 배스의 Genomic DNA와 Guide-it sgRNA Screening kit (Takarabio, USA)를 이용하 여 확인하였다. Screening 방법은 다음과 같다. 먼저 Target sequence가 포함된 amplicon을 증폭하기 위해 PCR을 수행 하였다. DNA 2㎕, 2X Terra PCR Direct Buffer 25㎕, primer 각각 1.5㎕(10pmol/㎕) (Table 1, 2), Terra PCR Direct Polymerase Mix (1.25 U/㎕) 1㎕, RNase Free Water 19㎕를 혼합하여 최종 50㎕ 용량으로 반응하였다. PCR 조건은 98℃에서 2분간 initial denaturation한 다음 9 8℃에서 10초, 60℃에서 15초, 68℃에서 90초를 1 cycle로 하여 35회 반복한 후, 4℃에 보관하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. 합성된 sgRNA가 Target sequence를 인식할 수 있는지는 Cas9에 의한 Target sequence의 절단 여부로 하였다. Target-specific sgRNA (50ng/㎕) 1㎕와 Guide-it Recombinant Cas9 Nuclease (500ng/㎕) 0.5㎕를 혼합하여 5분간 37℃에서 반응하였다. 이어서 상기 PCR 산물 5㎕, 15X Cas9 Reaction Buffer 1㎕, 15X BSA 1㎕, 상기 Cas9/sgRNA mix 1.5㎕, RNase Free Water 6.5㎕를 혼합하여 최종 15㎕ 용량으로 37℃에 서 1시간, 80℃에서 5분간 반응시킨 후 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. 전기영동 결과 DNA 밴드가 cleaved fragment 2개로 나타나는 경우는 합 성한 sgRNA가 Target sequence를 제대로 인식하여 유전자 편집이 성공적으로 실행되었다고 판단하였다.

7. Cas9-sgRNA ribonucleoprotein(RNP) complex 제작

Target sequence를 인식하고 절단하는 Cas9-sgRNA ribonucleoprotein (RNP) complex를 제작하기 위해 Guideit Recombinant Cas9 kit (Takarabio, USA)를 이용하였다. 효율성이 검증된 sgRNA 0.45㎕(1㎍/㎕), Guide-it Recombinant Cas9 0.75㎕(3㎍/㎕), Resuspension Buffer 6.3㎕를 섞어 최종 7.5㎕의 용량으로 5분간 37℃에서 반응하여 배스의 수정란에 Microinjector로 주입할 Cas9-sgRNA ribonucleoprotein (RNP) complex를 제작한 다음 -80℃에 보관하였다.

결 과

1. NGS를 이용한 전사체 분석 및 생식 유전자 탐색

배스의 RNA 서열분석 결과, 총 242,418,292개의 reads (B1-2는 129,816,500 reads, B2-1는 112,601,792 reads)와 24,484,247,492 bp (B1-2는 13,111,466,500 bp, B2-1는 11,372,780,992 bp)의 Raw data를 확보하였다(Table 4). Low quality 서열 및 adaptor 서열의 trimming을 통해 240,036,418개의 reads (B1-2는 128,492,724 reads, B2-1는 111,543,694 reads)와 24,061,325,429 bp (B1-2는 12,854,708,436 bp, B2-1는 11,206,616,993 bp)의 Trimming data를 확보하였 다(Table 5). Trinity를 이용한 de novo assembly 결과 Total trinity transcripts는 243,117개(235,627,133 bp), Total trinity 유전자는 189,512개를 확인하였고, TGICL을 이용한 clustering 결과 182,887개(132,127,994 bp)의 Unigene Contig를 확인하였다(Table 6). Gene ontology (GO) 분석으 로 획득한 contig들의 Annotation 결과는 기능별 즉, biological processes, cellular components, molecular function으로 나 누어 Figure 2에 나타내었다. Unigene Contig (이하 Contig) 정보를 활용하여 정자-난자 인식단백질과 관련한 키워드 ‘Sperm’, ‘Zona Pellucida’, ‘IZUMO’, ‘Acrosome’ 으로 검색 하여 1차 선별한 결과, 발현 단백질은 10종, 단백질과 관련된 Contig는 122개가 산출되었고 1차 선별한 Contig 정보는 Table 7에 나타내었다. 1차 선별정보를 대상으로 7종의 데이 터베이스에서 모두 검색되는 Contig들, 동시에 Blast 참조 유전자 서열과의 유사도가 80% 이상 되는 Contig들을 2차 선별한 결과, 단백질은 2종, 단백질과 관련된 Contig는 4종이 산출되었다. IZUMO1 단백질의 경우에는 3개의 Contig 그리 고 Zona pellucida sperm-binding protein의 경우에는 1개의 Contig가 산출되었고 2차 선별한 Contig 정보는 Table 8에 나타내었다.

2. CRISPR/Cas9 system을 적용할 Target Sequence 선정

각 Contig를 구성하는 염기서열에서 CRISPR/Cas9 시스 템을 적용했을 때 편집 가능한 서열(Target sequence) 즉, Cas9 nuclease가 인식하는 부위인 PAM (5‘-NGG-3’)을 가진 20bp의 염기서열을 후보 서열(Candidate Target sequence)이 라 하고 선정한 결과는 Figure 3, 4, 5, 6에 표시하였다. 후보 서열은 IZUMO1의 C69849_g1_i1은 7개(Figure 3), C82233 _g1_i1은 3개(Figure 4), C183992_g1_i1은 2개(Figure 5), 그리고 Zona pellucida sperm-binding protein의 C63950 _g1_i1은 15개(Figure 6-1, 6-2)로, 총 27개의 후보 서열을 선정하였다. 배스 DNA에서 동일한 서열의 존재 여부, Target sequence 내 intron 삽입으로 인한 CRISPR/Cas9 system 적용 불가능 여부를 확인하기 위해 각 후보 서열을 기준으로 Primer를 디자인, 제작하여 PCR을 수행한 후 최종 Target sequence를 선정하였고, 결과는 Table 9에 나타내었다. 최종 Target sequence는 IZUMO1의 C69849_g1_i1은 4개, C82233 _g1_i1은 3개, C183992_g1_i1은 2개, 그리고 Zona pellucida sperm-binding protein의 C63950_g1_i1은 12개로, 총 21개 의 최종 Target sequence를 선정하였다.

3. sgRNA 디자인 및 합성

최종 선정된 Target sequence에 유전자 편집기술을 적용하 는데 필수적인 sgRNA을 합성하기 위해 Target sequence별 해당 primer를 사용하여 sgRNA 합성용 template를 제작한 결과, 전기영동 Gel상에서 약 130bp의 DNA band로 관찰되 었다(Figure 7). Guide-it sgRNA In Vitro Transcription kit (Takarabio, USA)와 Guide-it IVT RNA Clean-Up kit (Takarabio, USA)를 이용하여 합성한 sgRNA의 합성량은 Table 10에 나타내었다.

4. sgRNA 효율성 Screening

제작한 sgRNA가 Target sequence를 인식할 수 있는지 확인하기 위해 Target sequence 절단 여부를 Agarose 전기 영동 방법으로 실험한 Target별 sgRNA Screening 결과는 다음과 같다(Figure 8, 9, 10, 11). IZUMO1 (C69849_ 1_i1) 의 경우, Target 3과 5를 인식하는 sgRNA가 정상적으로 작동하여 sequence의 절단 현상이 나타났고, Target 2와 6 을 인식하는 sgRNA는 정상적으로 작동하지 않아 sequence 의 절단 현상이 나타나지 않았다(Figure 8). IZUMO1 (C82233_g1_i1)의 경우, Target 8, 9, 10을 인식하는 sgRNA 가 정상적으로 작동하여 sequence의 절단 현상이 나타났다. Target 8과 10에서는 Uncleaved fragment가 절단된 것은 확인되었으나 cleaved fragments 2개 중 1개는 200bp 이하 이기 때문에 전기영동 결과인 gel band의 육안 식별이 안 되는 것으로 추정되었다(Figure 9). IZUMO1 (C183992_g1 i1)의 경우, Target 11과 12를 인식하는 sgRNA가 정상적으 로 작동하여 sequence의 절단 현상이 나타났다. Target 11 과 12에서는 Uncleaved fragment가 절단된 것은 확인되었 으나 cleaved fragments 2개 중 1개는 200 bp 이하이기 때 문에 전기영동 결과인 gel band의 육안 식별이 되지 않는 것으로 추정되었다(Figure 10). Zona pellucida sperm-inding protein (C63950_g1_i1)의 경우, 모든 Target 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26을 인식하는 sgRNA가 정상적으로 작동하여 sequence가 절단된 것을 확인하였다. Target sequence 23, 24, 25에서는 Uncleaved fragment가 절단된 것은 확인하였으나 cleaved fragments 2개 중 크기가 작은 cleaved fragment는 구분이 되지만 크기가 큰 cleaved fragment는 Uncleaved fragment와 육안 구분이 되지 않았 다(Figure 11-1, 11-2, 11-3). sgRNA 효율성 Screening 결 과에서 정상 작동하는 sgRNA는 IZUMO1 (C69849_g1_ i1)의 경우에는 Target sequence 3과 5, IZUMO1 (C82233_ g1_i1)의 경우에는 Target sequence 9, Zona pellucida sperm-binding protein (C63950_g1_i1)의 경우에는 Target sequence 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 26으로 확인되었다.

5. Cas9-sgRNA ribonucleoprotein(RNP) complex 제작

sgRNA 효율성 Screening 결과 cleaved fragments 2개 중 1개라도 육안 구분이 안 되는 경우는 Cas9-sgRNA ribonucleoprotein (RNP) complex 제작에 사용하지 않고 Target sequence 절단이 명확하게 확인되는 sgRNA 12종을 이용하여 Cas9-sgRNA ribonucleoprotein (RNP) complex 를 제작하였다.

고 찰

최근까지 생태교란어종인 배스(Micropterus salmoides) 의 생태 및 생식적 특성에 기반하고 있는 다양한 관리 방법, 즉 낚시법, 투망법, 정치망법, 자망법, 족대법, 펌핑법, 작살 법, 전기충격법, 인공 산란장법, 천적법 등이 제시되고 있으 나 실제적인 시행의 결과와 효과의 검증은 미흡한 상황이라 할 수 있다.

2014년과 2020년에 국립공원연구원에서는 소백산국립공 원의 금계저수지, 속리산국립공원의 삼가저수지, 내장산국 립공원의 내장저수지의 어류상을 조사하여 블루길과 배스에 의한 한국 고유종의 개체수 영향과 제거 방식의 효율성을 분석하였다. 2014년과 비교하면 2020년 조사에서 금계저수 지의 경우, 배스가 가장 높은 비율로 서식하고, 블루길의 새로운 서식이 확인되었고, 과거에 출현했었던 붕어(Carassius auratus), 돌고기(Pungtungia herzi), 자가사리(Liobagrus mediadiposalis), 얼록동사리(Odontobutis interrupta), 갈문 망둑(Rhinogobius giurinus)은 출현하지 않았고, 참갈겨니 (Zacco koreanus)와 피라미(Zacco platypus), 메기(Silurus asotus), 밀어(Rhinogobius brunneus) 등은 급격하게 감소한 것으로 나타났다. 삼가저수지의 경우, 배스가 급격하게 증가 하였고, 과거에 출현했었던 빙어(Hypomesus nipponensis), 가물치(Channa argus)가 출현하지 않았고, 참몰개(Squalidus chankaensis tsuchigae), 피라미, 밀어 등은 급격하게 감소한 것으로 나타났다. 내장저수지의 경우, 배스가 처음으로 확인 되었고, 과거에 출현했었던 잉어(Cyprinus carpio), 납자루 (Acheilognathus lanceolata), 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus), 왜매치(Abbottina springeri), 참붕어(Pseudorasbora parva), 점줄종개(Cobitis lutheri), 메기, 빙어, 대륙송사리(Oryzias sinensis), 갈문망둑, 가물치(Channa argus) 등 12종이 출현 하지 않았다. 국립공원연구원은 이 연구 결과로 2020년에 소형 어류의 개체수 급감이나 소멸은 생태계교란 생물로 지정된 포식성이 강한 육식성 어종인 배스에 의한 것으로 추정하였고, 블루길과 배스의 출현 개체수를 산정, 비교했을 때 현재 제거방식의 효율성에 대하여 재고할 필요가 있다고 보고하였다(NPRI, 2014;NPRI, 2020).

확산방지 및 관리를 위한 기술적인 대처 방안 중 인공 산란장법은 배스의 생식 습성을 이용하여 산란을 유도한 후 수정란을 제거하는 번식 차단방식으로서 다른 방식에 비해 수백 개에서 1만개에 이르는 상당수의 개체를 한 번에 포획, 제거할 수 있는 유일한 방법이지만 인공 산란장을 설 치하더라도 그 외의 산란장소가 있는 경우에는 알의 포획 효과가 낮다는 단점을 갖고 있다(ME, 2012). 본 연구의 내 용은 인공 산란장법이 수정란 상태에 있는 상당수의 개체를 한꺼번에 포획, 제거할 수 있는 효과를 가진다는 장점과 적 절한 산란장소가 있는 경우 포획, 제거 효과가 낮다는 단점 에서 착안하였다. 상당한 시간, 경비, 인력을 필요로 하는 성체 배스의 포획, 제거 방식 보다는 수정란 상태에서 다수 의 개체를 한꺼번에 포획하는 방식이 효율적이지만 단점을 보완하여 수정란 포획 방식보다는 수정 이전의 상태에서 번식을 차단하는 방식이 훨씬 더 효율적일 것이라고 판단하 고 번식행동은 하지만 수정란은 형성하지 못하는 불임개체 의 유도 방법을 모색하였다.

최근에는 유전자 편집기술의 발전과 더불어 CRISPR/ Cas9 system을 질환매개 해충의 방제에 이용하여 곤충 매 개질환의 전파 차단에 활용하기도 한다. Kyrou et al.(2018) 의 연구에서는 말라리아를 일으키는 원충을 매개하는 얼룩 날개모기(Anopheles gambiae)를 대상으로, 생식 능력을 부 여하는 특정 유전물질을 유전자 가위로 잘라 유전자를 편집 하여 모기의 불임을 유도하고 불임 모기와의 세대별 교미를 통해 모기를 박멸시켜 실험에 사용된 ‘모기 가계‘가 모두 멸종하는 것을 확인하였다. Zheng et al.(2019)의 연구에서 는 소두증을 유발하는 지카바이러스를 매개하는 이집트 숲 모기(Aedes aegypti)를 대상으로, 모기 수컷에 방사선을 조 사하여 불임을 유도한 후 무정자 모기로 번식이 불가능하게 하였고, 유전자 조작 기술로 유충이 자라지 않는 유전자를 수컷에 삽입하여 교미 후 알에서 태어난 유충이 성충으로 자라지 못하고 죽도록 만들어 번식을 차단하는 방법으로 누적 모기 퇴치율 82%를 달성하였다. 이러한 두 연구는 인 간에게 질환을 유발하는 병원체를 매개하는 곤충의 불임개 체를 이용하거나 유전자 조작 기술로 번식을 차단함으로써 인류의 건강에 악영향을 미치는 생물종 퇴치 방법의 유용성 을 입증한 사례라고 할 수 있다.

본 연구에서 가장 먼저 수행한 실험은 유전자 편집을 위한 생식세포의 표적 유전자 선별 즉, 종 특이적 정자-난자 인식 단백질을 암호화하는 유전자의 탐색이었다. 생식세포 유전자 편집에 앞서 표적 유전자 선별과정에 필수적인 배스의 유전자 정보 즉, whole genome sequencing(WGS) 자료가 전무했기 때문에 본 실험에서는 Transcriptome de novo Sequencing (RNAseq.)을 수행하여 배스의 Transcript 정보를 획득하였다 (Fu and He, 2012;Zhao et al., 2018). 배스의 Transcriptome 분석 결과, 각 샘플별 약 100milion sequencing reads를 de novo assembly하여 전체 trinity transcript는 243,117개를, 전체 trinity 유전자는 189,512개를 얻었고, 전체 Unigene contigs는 182,887개 확인하였다. 7종의 데이터베이스를 참 고하여 이미 알려진 단백질과 sequence 유사성을 조사한 blastX 분석 결과, 63,662개(34.81%) 유전자가 annotation되 어 정자-난자 인식단백질을 발현하는 유전자를 탐색하기에 충분한 데이터베이스를 구축하였다고 판단된다. 획득한 배스 의 Transcript 정보로부터 유전자를 탐색할 때에는 정자-난자 인식단백질을 발현하는 유전자의 서열 정보에 집중할 수 있도록 편집 대상 단백질의 종류를 최소로 제한하였다. 정자- 난자 인식단백질과 관련한 키워드 ‘Sperm’, ‘Zona Pellucida’, ‘IZUMO’, ‘Acrosome’ 으로 검색하여 Contig들을 1차 선별 하고, 7종의 데이터베이스에서 모두 검색되면서 Blast 참조 유전자 서열과의 유사도가 80% 이상 되는 contig들을 2차 선별한 결과, 단백질은 2종, 단백질과 관련된 contig는 4개가 산출되었다. IZUMO1 단백질의 경우 3개의 contig, Zona pellucida sperm-binding protein의 경우 1개의 contig가 산출 되었다. 선별된 각 contig별로 PAM (5‘-NGG-3’)을 가진 20bp의 염기서열을 탐색한 결과 총 27개의 후보 서열이 선정 되었고, 배스의 genomic DNA 내 존재여부와 인트론 삽입여 부를 확인한 결과로 총 21개 최종 Target sequence가 선정되 어 유전자 편집의 높은 성공률이 보장되었다고 판단된다. 최종 선정된 Target sequence에 유전자 편집기술을 적용할 수 있도록 sgRNA을 제작하고, 제작된 sgRNA의 효율성을 검증한 결과 IZUMO1의 C69849_g1_i1은 Target 3, 5, C82233_g1_i1은 Target 9, 그리고 Zona pellucida spermbinding protein의 C63950_g1_i1은 Target 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 26, 총 12개 sequence가 도출되었다. Target sequence의 절단이 확인된 sgRNA 사용은 유전자 편집 성공 률을 상당히 높은 수준에 까지 이르게 할 것이라고 기대한다. Target sequence 절단이 명확하게 확인되는 sgRNA 12종을 이용하여 Cas9-sgRNA ribonucleoprotein (RNP) complex를 제작하였고, 제작한 RNP complex는 후속 연구에 활용할 계획이다.

후속 연구 내용은 다음과 같다. 배스의 산란 시기에 수컷 의 정자와 암컷의 난자를 채취한 후 수정을 유도하고 수정 된 수정란에 microinjector로 RNP를 주입함으로써 종 특이 적인 정자 또는 난자 인식 단백질의 암호화된 염기서열 (Target sequence)을 편집한다(Elaswad et al., 2018). 유전 자 편집으로 번식행동은 하지만 수정란을 형성하지 못하는 생식세포를 생산하는 불임개체를 유도한다. 불임이 유도된 개체를 이용하여 개체군 감소의 효과는 메조코즘(mesocosm) 방식(Graney et al., 1994)을 활용한 실험실적 검증을 거친 다음 저수지별 현장 검증으로 확인할 계획이다.

자연계에 유입된 생태계교란어종을 멸종단계까지 박멸 한다는 것은 사실상 불가능하므로 일정 수준 이하로 밀도를 감소시키면 토종 어류들의 경쟁력이 상대적으로 증가하여 생태계가 자연스럽게 균형을 이룰 수 있으므로 본 연구는 현실적으로 매우 유용한 생태교란어종 관리방안 수립에 활 용될 수 있을 것으로 기대한다.

본 연구에서는 배스의 종 특이적 정자-난자 인식 단백질 을 암호화하는 유전자를 탐색하였고, CRISPR/Cas9 시스템 을 활용하여 수정 과정에 필수적인 종 특이적 인식부위를 유전자 편집을 통해 발현되지 않도록 유도하는 불임유도 조성물의 개발 과정을 확립하였다. 그리고 배스와 동일한 수생태계에 속해 있는 고유 생물종의 서식에는 영향을 미치 지 않는 효율적인 생태교란종 관리 방안으로서의 유용성을 검증하기 위한 후속 연구의 귀중한 기초 자료를 확보하는데 기여했다고 판단된다.